Các xét nghiệm đông máu: những kháng thể kháng phospholipid  (apls)

Phần 1: giới thiệu

Rất quan trọng phải nhớ rằng APLs có thể hiện diện một cách yên lặng sau khi ốm, đặc biệt là nhiễm trùng và không nên kết luận cho đến khi một test thứ 2 được thực hiện. APLs yên lặng hiếm khi liên kết với huyết khối.

APS có thể xảy ra trong bối cảnh một bệnh lý khác (APS thứ phát), chủ yếu là rối loạn tự miễn, SLE và xơ cứng bì (scleroderma).

Những người có cả LA và hiệu giá kháng thể anticardiolipin vừa/cao cho thấy nguy cơ huyết khối cao hơn những người chỉ có 1 test dương tính.

Việc xác định LA ở bệnh nhân dùng VKA là khó. Khuyến cáo ngưng VKA 1-2 tuần và khi INR  

Ảnh hưởng của LMWH lên sàng lọc LA là thay đổi. Một số kit thương mại cho sàng lọc LA có chứa sẵn thuốc thử trung hòa heparin như polybrene.

Giới thiệu 

APL phá vỡ quá trình đông máu và quan trọng vì 2 lý do:

Chúng có thể kéo dài những xét nghiệm đông máu phụ thuộc phospholipid như APTT, cho ra một ấn tượng về một rối loạn chảy máu tiềm tang NHƯNG

In vivo chúng có thể thúc đẩy huyết khối (Hội chứng kháng phospholipid – APS), và cũng có thể sự hiện diện của chúng hoàn toàn không có triệu chứng. Rất quan trọng xác định APL vì chúng có thể giải thích những đợt huyết khối và xảy thai tái diễn trong 3 tháng đầu. Thêm vào đó, nếu không được nhận ra, APL có thể kéo dài test đông máu và tiếp đó là xét nghiệm yếu tố dẫn đến diễn dịch nhầm lẫn là suy giảm yếu tố đông máu. May mắn là trong trường hợp sau, một số đầu mối dựa vào đồ thị không song song trong xét nghiệm yếu tố có thể phát hiện ra.

Chẩn đoán APS đòi hỏi sự kết hợp của ít nhất một test LABO đặc hiệu và một hoặc nhiều hơn các triệu chứng lâm sàng:

Tiêu chuẩn lâm sàng
Huyết khối mạch máu	Một hoặc nhiều đợt huyết khối động mạch, tĩnh mạch, hoặc mạch máu nhỏ ở bất cứ mô hay cơ quan nào. Huyết khối phải được xác định bằng những tiêu chuẩn có giá trị (hình ảnh hoặc mô học rõ ràng)
Thai lưu	Một hoặc nhiều những đợt thai lưu không giải thích được, bình thường về mặt hình thái tại thời điểm 10 tuần.  Một hoặc nhiều những lần sinh non bình thường về mặt hình thái trước tuần 34 vì: Sản giật hoặc tiền sản giật nặng hoặc Nhận ra những đặc điểm bánh nhau không đầy đủ.  3 hoặc nhiều hơn những đợt xảy thai tự động trước tuần 10 đã loại trừ các bất thường giải phẫu/ hormone/ NST.
Tiêu chuẩn LABO Ít nhất 2 test dương tính cho APL cách nhau 12 tuần
Trực tiếp	ELISA Nguyên lý:  3 đặc điểm cho việc xác định APL chính xác là:  Chống trực tiếp hoặc cardiolipin (aCL) hoặc β2glycoprotein-I (anti-β2GPI)  IgG và/ hoặc IgM  Hiện diện với chuẩn độ trung bình hoặc cao (i.e. >40 GPLU hoặc MPLU đối với aCL hoặc >the 99th percentile đối với hoặc aCL hoặc anti-β2GPI. Cardiolipin được tìm thấy gần như độc quyền ở lớp trong màng ty thể, nơi nó thực hiện vai trò quan trọng trong việc điều hòa những enzyme liên quan đến chuyển hóa năng lượng của ty thể. Thuật ngữ “cardiolipin” xuất phát từ sự việc là lần đầu nó được phân lập từ trái tim của con bò những năm đầu 1940 và tạo thành nền tảng cho xét nghiệm Wasserman cho giang mai. β2-glycoprotein I (còn được biết là Apolipoprotein H) là một protein đa chức năng: gắn vào cardiolipid và làm thay đổi cấu hình, tương tác với quá trình ngưng tập tiểu cầu bằng việc ức chế bài tiết serotonine và tương tác với nhiều bước khác trong con đường đông máu. Những kháng thể gắn β2GPI có mối liên quan chặt chẽ với những biến chứng huyết khối trong APS.
Gián tiếp	Thông qua ảnh hưởng lên xét nghiệm đông máu phụ thuộc phospholipid. Nguyên lý  APL có thể ảnh hưởng lên phospholipid được sử dụng ở một số LABO trong các xét nghiệm đông máu (như APTT) và làm kéo dài thời gian cục đông. Ảnh hưởng này có thể vượt qua bằng cách cho thêm lượng dư phospholipid trung hòa APL và thời gian in vitro sẽ ngắn lại.
	Việc chứng minh sự hiện diện APL bởi những test đông máu đòi hỏi: Kéo dài những test đông máu phụ thuộc phospholipid VÀ Rút ngắn lại khi cho dư phospholipid hoặc loại bỏ ảnh hưởng của APL bằng cách nào đó HOẶC So sánh với test xác định độc lập với phospholipid. Những test được dùng cho mục đích này là: Dilute Russell Viper venom test (DRVVT) Silica clotting time (SCT)   Kaolin clotting time (KCT)  The Textarin/Ecarin time  Taipan venom time (TVT)  Factor V ratio  Không có một test nào ở trên có thể xác định được tất cả LA. Vì vậy ít nhất 2 test khác nhau nên được sử dụng

Sơ đồ dưới đây cho thấy trình tự điều tra một trường hợp nghi ngờ LA

Khi sàng lọc LA, 2 test dựa vào những nguyên lý khác nhau nên được sử dụng. Khuyến cáo hiện tại của ISTH SSC khuyến cáo sử dụng Silica Clotting Time [SCT] và dilute Russell Viper Venom Time [dRVVT].

Đề nghị xét nghiệm nào tiếp?

Để hoàn thành xét nghiệm APL, mẫu máu bệnh nhân cần được thử 2 lần cách nhau 12 tuần.

Công thức máu cũng cần được kiểm tra vì APL có thể gây nên ITP. APL cũng có thể gây nên suy giảm prothrombin mắc phải và ở bệnh nhân APL với tiền sử chảy máu, việc đo mức FII rất có giá trị.

Tài liệu tham khảo

Pengo, V., Tripodi, A., Reber, G., Rand, J.H., Ortel, T.L., Galli, M. & De Groot, P.G. (2009) Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. J Thromb Haemost, 7, 17371740.

Urbanus, R.T., Derksen, R.H. & de Groot, P.G. (2008) Current insight into diagnostics and pathophysiology of the antiphospolipid syndrome. Blood Rev, 22, 93-105.

Miyakis, S., Lockshin, M.D., Atsumi, T., Branch, D.W., Brey, R.L., Cervera, R., Derksen, R.H., PG, D.E.G., Koike, T., Meroni, P.L., Reber, G., Shoenfeld, Y., Tincani, A., Vlachoyiannopoulos, P.G. & Krilis, S.A. (2006) International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost, 4, 295-306.

Greaves, M., Cohen, H., MacHin, S.J. & Mackie, I. (2000) Guidelines on the investigation and management of the antiphospholipid syndrome. Br J Haematol, 109, 704715.

Brandt, J.T., Triplett, D.A., Alving, B. & Scharrer, I. (1995) Criteria for the diagnosis of lupus anticoagulants: an update. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulant/Antiphospholipid Antibody of the Scientific and Standardisation Committee of the ISTH. Thromb Haemost, 74, 1185-1190.

Plebani M. Errors in clinical laboratories or errors in laboratory medicine? Clin Chem Lab Med 2006;44:750-9.

BCSH Guidelines on the investigation and management of antiphospholipid syndrome [2012].

Phần 2. thời gian nọc độc russell’s viper pha loãng dilute russell’s viper venom time [drvvt]

Việc chuẩn bị PPP cho DRVVT cũng như tất cả các test LA là quan trọng. Mẫu huyết tương phải được quay gấp đôi để loại bỏ tất cả tiểu cầu vì nó có thể trở thành một nguồn cung cấp PL khác trong test. Tương tự mẫu không nên đông lại vì tiểu cầu sau đó sẽ bị dung giải và phóng thích PL trong quá trình rã đông.

Kháng thể chống FV hoặc suy giảm FV sẽ làm kéo dài DRVVT nhưng việc kéo dài sẽ không được điều chỉnh khi thêm phospholipid ở bước hiệu chỉnh.

Heparin sẽ kéo dài DRVVT nhưng nó cũng sẽ kéo dài Thrombin Time (TT), trong khi APL rất hiếm khi gây kéo dài TT. Nếu TT kéo dài, thực hiện RT sẽ xác nhận sự hiện diện của heparin.

DRVVT không tin tưởng được khi bệnh nhân uống warfarin. Một số LABO thực hiện mix 1:1 với huyết tương bình thường để làm giảm tối thiểu ảnh hưởng.

Test hiệu chỉnh (confirm theo cách gọi của LABO chúng ta) trước đây người ta dùng tiểu cầu ly giải. Tuy nhiên, hầu hết LABO hiện nay sử dụng phospholipid tinh khiết vì điều này sẽ chuẩn hơn.

Đọc thêm bài nọc độc rắn trong đông máu (Snake Venoms in Haemostasis)

Giới thiệu 

RVV được phân lập từ rắn Daboia russelii chứa một chất hoạt hóa FX khi có mặt PL, prothrombin, calcium chuyển fibrinogen thành fibrin. Những người có LA gắn với PL sẽ ức chế hoạt động của RVV và làm kéo dài CT (Clotting time).

Vì RVV hoạt hóa trực tiếp FX vì vậy test không bị ảnh hưởng bởi suy giảm yếu tố FXII, XI, IX hoặc VIII. DRVVT thường được kết hợp với động tác trung hòa tiểu cầu để chứng minh sự đặc hiệu với PL của kháng thể.

Phương pháp

Huyết tương bình thường được trộn với PL pha loãng tại 37 độ C. RVV pha loãng và sau đó calcium chloride được thêm vào, CT được ghi lại. Test sau đó được lặp lại với huyết tương bệnh nhân và tỷ số giữa bệnh nhân/chứng được tính toán.

Thuốc thử	Giải thích
PPP	Một nguồn của các yếu tố đông máu, đặc biệt là thrombin và fibrinogen.
RVV pha loãng	Nó được pha loãng để CT của huyết tương chứng vào khoảng 30-35 giây vì đây là độ nhạy tối ưu cho APL.
PL	Cung cấp bề mặt cho sự tạo thành thrombin.
Calcium	Khởi động đông máu

Phân tích kết quả

Nếu DRVVT không kéo dài thì test hiệu chỉnh không được chỉ định.

DRVVT	Phân tích
DRVVT  Tỉ số DRVVTtest/chứng	Khoảng tham chiếu: 29-42 giây Khoảng tham chiếu: 0.9-1.05
Tỷ số >1.05	Có thể LA Loại trừ suy giảm các yếu tố II, V, X, Fibrinogen hoặc chất ức chế khác không phải LA
DRVVT kéo dài hiệu chỉnh được với huyết tương bình thường.	Suy giảm yếu tố đông máu (Một LA yếu có thể bị che giấu ở mix 1:1 với huyết tương bình thường, một số LABO khuyến cáo mix 1:4 (1 test, 4 NPP) để thử lại)
DRVVT kéo dài hiệu chỉnh lại với PL	LA

Tính phần trăm hiệu chỉnh

Phần trăm hiệu chỉnh được tính bằng cách sử dụng công thức sau

Phần trăm hiệu chỉnh của tỉ số được tính bằng công thức bên dưới. Kết quả cuối cùng được nhân 100 để thành đơn vị %. Cách tính này hiện đã được khuyến cáo bởi Hiệ hội chuẩn hóa Huyết học của Anh quốc (British Committee for Standardisation in Haematology [BCSH.])

Xem ví dụ sau

Mẫu	CT của DRVVT (giây)	Tỷ số
Huyết tương bệnh nhân	69.2	1.82
NPP	37.9
Huyết tương bệnh nhân + PL	39.5	1.21
NPP + PL	32.5

Từ dữ liệu trên:  [1.82 – 1.21/1.82] x 100 = 33.5% hiệu chỉnh. Như vậy bệnh nhân này kết luận có LA.

Khi nào thì dương tính? Nhiều LABO chọn mức hiệu chỉnh >10% là test dương tính.

Đề nghị xét nghiệm nào tiếp?

Khi một người với LA dương tính, test nên được lặp lại lúc 12 tuần. Nhớ rằng không có test nào có thể phát hiện tất cả LA, vì vậy nếu vẫn nghi ngờ một bệnh nhân có LA thì một test khác nên được thực hiện như SCT. Cuối cùng, nguyên nhân của LA nên được sàng lọc như ANA, thuốc, virus…

Tài liệu tham khảo

Shapiro SS. The lupus anticoagulant/antiphospholipid syndrome. Annu Rev Med. 1996;47(533):533-53.

Triplett DA. Antiphospholipid antibodies, lupus anticoagulants and thromboembolic disease. Haematologica. 1995.

Kampe CE. Clinical syndromes associated with lupus anticoagulants. [Review]. Seminars in Thrombosis & Hemostasis. 1994;20(1):16-26.

Tripodi A, Chantarangkul V, Clerici M, Mannucci PM. Laboratory diagnosis of lupus anticoagulants for patients on oral anticoagulant treatment. Performance of dilute Russell viper venom test and silica clotting time in comparison with Staclot LA. Thromb Haemost. 2002 Oct;88(4):583-6.

Triplett DA. Use of the dilute Russell viper venom time (dRVVT): its importance and pitfalls. J Autoimmun. 2000 Sep;15(2):173-8.

Thiagarajan P, Pengo V, Shapiro SS. The use of the dilute Russell viper venom time for the diagnosis of lupus anticoagulants. Blood. 1986 Oct;68(4):869-74.

BCSH Guidelines on the Investigation and Management of antiphospholipid Syndrome.

Phần 3. kaolin clotting time [kct]

Thuật ngữ “KCT” đôi khi được dùng để viết tắt cho Kaolin Cephalin Time – một tên gọi khác của APTT. Điều này có thể dẫn đến nhẫm lẫn vì Kaolin Clotting Time là một test khác, không cho PL (Cephalin) vào và được dùng để sàng lọc LA.

Giới thiệu 

KCT được xem như test nhạy nhất trong việc xác định chống đông lưu hành. KCT xác định tất cả các loại chất ức chế, bao gồm cả những chất ức chế chống trực tiếp FVIII, nhưng nó cũng nhạy với sự có mặt của UFH.

Nguyên lý

KCT được thiết kế như APTT nhưng không cho thêm bất kỳ PL nào. Test dựa vào những mảnh màng tế bào và lipid huyết tương để cung cấp bề mặt PL cho phản ứng đông máu.

Phương pháp

Pha loãng huyết tương bệnh nhân: huyết tương bình thường theo tỷ lệ như trong bảng. Kaolin và sau đó calcium được thêm vào. Thời gian KCT được đo lại. Kaolin làm vẩn đục dung dịch nên khó xác định điểm cuối nếu đo bằng quang học, thường đòi hoi phải làm tay. Tuy nhiên, gần đây người ta đã tạo ra các kaolin ít gây đục, có thể đo tự động được.

Normal Plasma	Patient Plasma
100%	0%
90%	10%
80%	20%
50%	50%
20%	80%
10%	90%

Không có bước cho PL vào để làm test khẳng định đối với KCT. Thay vào đó, để loại trừ suy giảm yếu tố gây kéo dài KCT, một lượng lớn huyết tương bình thường được cho vào, nếu rút ngắn thì sẽ là thiếu hụt, nếu không sẽ chứng tỏ sự hiện diện kháng đông. 

Test tại độ pha loãng 80:20 được dùng như một test sàng lọc. Tỷ số >=1.2 được xem như dương tính với LA mặc dù khoảng tham chiếu nên được xây dựng theo mỗi LABO.

Chỉ số Rosner: giá trị bình thường là

Phần trăm của Chang:

Ban đầu Chang và cs cũng sử dụng mix 50:50, kết quả dương tính khi >70%, giá trị biên là 58-70%

Sau đó Chang và cs thấy mix 4:1 cho kết quả nhạy hơn; dương tính khi >50%.

Phân tích kết quả

KCT sử dụng một lượng nhỏ phospholipid trong huyết tương bệnh nhân và vì vậy rất nhạy với sự nhiễu của tiểu cầu trong mẫu (điều này làm giảm đáng kể độ nhạy của test, đặc biệt sau khi đông và rã đông sẽ làm vỡ màng tiểu cầu và phóng thích ra một lượng lớn bề mặt cho đông máu). Một KCT

KCT của test được so với chứng. Nếu tỷ số test/chứng >= 1.2 hướng đến một chất ức chế (1.1-1.2 được xem là ranh giới). Suy giảm yếu tố phân biệt với APL bằng cách cho lượng lớn huyết tương bình thường vào sẽ hiệu chỉnh được KCT. Nếu CT ở những độ pha loãng khác nhau được biểu diễn trên giấy Log-Lin, hàng loạt đường cong được tạo ra như hình dưới

Tóm tắc các đường cong KCT

Đường cong	Diễn giải
Type 1	Hiện diện LA.  KCT tại độ pha loãng 0% nên >60 giây, nếu không thì huyết tương bình thường chứa nồng độ PL quá cao làm mất độ nhạy. Nhớ rằng KCT chỉ sử dụng nguồn PL trong huyết tương test.
Type 2	LA + Suy giảm yếu tố
Type 3	LA hiện diện nhưng không có β2-GPI
Type 4	Không có LA hiện diện

Đề nghị xét nghiệm nào tiếp?

Khi một người với LA dương tính, test nên được lặp lại lúc 12 tuần. Nhớ rằng không có test nào có thể phát hiện tất cả LA, vì vậy nếu vẫn nghi ngờ một bệnh nhân có LA thì một test khác nên được thực hiện như SCT. Cuối cùng, nguyên nhân của LA nên được sàng lọc như ANA, thuốc, virus…

Tài liệu tham khảo

Exner T, Rickard KA, Kronenberg H. A sensitive test demonstrating lupus anticoagulant and its behavioural patterns. Br J Haematol. 1978 Sep;40(1):143-51.

Exner T. Comparison of two simple tests for the lupus anticoagulant. Am J Clin Pathol. 1985 Feb;83(2):215-8.

Exner T, Triplett DA, Taberner DA, Howard MA, Harris EN. Comparison of test methods for the lupus anticoagulant: international survey on lupus anticoagulants-I (ISLA1). Thromb Haemost. 1990 Nov 30;64(3):478-84.

Exner T. Some recent developments with lupus anticoagulants. Blood Coagul Fibrinolysis. 1994 Apr;5(2):281-9.

Exner T, Hohnen-Behrens C, Newman P, Dargan W. Effect of instruments on lupus anticoagulant testing. Thromb Haemost. 2000 Feb;83(2):345-8.

Chang, S.H., Tillema, V. & Scherr, D. (2002) A “percent correction” formula for evaluation of mixing studies. Am J Clin Pathol, 117, 62-73.

Phần 4. silica cloting time [sct]

Giới thiệu 

SCT chính là APTT nhưng slica được dùng thay cho kaolin.

Nguyên lý

Silica dạng keo trộn với PPP, calcium để khởi động đông máu. SCT chứa một lượng ít PL, nên nó rất nhạy với sàng lọc LA. Test khẳng định được thực hiện tương tự bằng cách cho lượng dư PL vào.

Heparin sẽ tương tác với test nhưng một số kit thương mại có chứa sẵn chất trung hòa heparin như polybrene

Thuốc thử	Giải thích
PPP	Một nguồn của các yếu tố đông máu, đặc biệt là thrombin và fibrinogen.
Silica dạng keo	Chất hoạt hóa đường nội sinh
PL	Cung cấp bề mặt cho sự tạo thành thrombin. Liều thấp được dùng để sàng lọc, liều cao để khẳng định.
Calcium	Khởi động đông máu

Phân tích kết quả tính phần trăm hiệu chỉnh

Phần trăm hiệu chỉnh được tính theo cách nguyên thủy 

Hiện nay, cách tính có thay đổi

Tỷ số SCT cho test sàng lọc:   Patient Screen SCT [s]/Mean of SCT Screen Reference Range [s]

Tỷ số SCT cho test khẳng định Patient Confirm SCT [s]/Mean of SCT Confirm Reference Range [s]

Chỉ số bình thường hóa được tính: Tỷ số test sàng lọc/Tỷ số test khẳng định

Tỷ số này >1.16 (1.24 ở một số máy) hướng đến hiện diện LA; ngược lại, hướng đến suy giảm yếu tố.

Xem ví dụ sau

Mẫu	CT của DRVVT (giây)	Tỷ số
Huyết tương bệnh nhân	210.3	3.22
NPP	65.2
Huyết tương bệnh nhân + PL	62.2	1.04
NPP + PL	32.5

Từ dữ liệu trên:  [3.22 – 1.04/3.22] x 100 = 67.7% hiệu chỉnh. Như vậy bệnh nhân này kết luận có LA.

Test này kém nhạy với heparin do có polybrene, nó cũng kém nhạy với kháng đông đường uống và cho ra một kết quả bình thường ở người bệnh gan có rối loạn đông máu. Test này không hiệu quả trong việc phân biệt LA và kháng thể kháng FVIII. 

Đề nghị xét nghiệm nào tiếp?

Khi một người với LA dương tính, test nên được lặp lại lúc 12 tuần. Nhớ rằng không có test nào có thể phát hiện tất cả LA, vì vậy nếu vẫn nghi ngờ một bệnh nhân có LA thì một test khác nên được thực hiện như SCT. Cuối cùng, nguyên nhân của LA nên được sàng lọc như ANA, thuốc, virus…

Tài liệu tham khảo

Luddington, R., et al. (1999) Lupus anticoagulant testing with optical end point automation. Thromb Res, 96, 197-203.

Chantarangkul, V., et al. (1992) Silica clotting time (SCT) as a screening and confirmatory test for detection of the lupus anticoagulants. Thromb Res, 67, 355-365

Phần 5. tỷ số yếu tố v  (factor v ratio)

Tỷ số FV PT:FV APTT ở người có LA, tương quan tốt với DRVVT.

Độ mạnh của test nằm ở chỗ khả năng của sàng lọc LA ở bệnh nhân dùng warfarin.

Giới thiệu 

LA có liên quan đến APCr thông qua ảnh hưởng hoạt động FV. 

Nguyên lý

Tỷ số FV dựa vào một phát hiện là PT thường bình thường hoặc chỉ kéo dài nhẹ ở những người có LA trong khi APTT kéo dài hơn. Test này suy ra một tỷ số hoạt tính FV sử dụng xét nghiệm dựa vào PT với dựa vào APTT.

Phương pháp

Hoạt tính FV được đo bằng phương pháp PT một giai đoạn và APTT một giai đoạn, từ đó tỷ số được suy ra.

Phân tích kết quả

Tỷ số này rất chặt ở người bình thường với giá trị trung bình 1.09±0.1. Tỷ số này cao hơn đáng kể ở người có LA 4.82±3.34. Một người có LA và dùng warfarin có tỷ số tương tự 4.82±3.34.

Đề nghị xét nghiệm nào tiếp?

Khi một người với LA dương tính, test nên được lặp lại lúc 12 tuần. Nhớ rằng không có test nào có thể phát hiện tất cả LA, vì vậy nếu vẫn nghi ngờ một bệnh nhân có LA thì một test khác nên được thực hiện như SCT. Cuối cùng, nguyên nhân của LA nên được sàng lọc như ANA, thuốc, virus…

Tài liệu tham khảo

Amagai, H., Kanda, T., Shizuka, R., Fukumura, Y. & Kobayashi, I. (1999) Ratio of factor V activities in PT and APTT assays as a new diagnostic marker of lupus anticoagulant. Clin Lab Haematol, 21, 45-49