ĐỊNH TÍNH PHOSPHO HỮU CƠ – NƯỚC TIỂU
Phospho hữu cơ là chất ức chế mạnh các carboxylic ester hydrolase bao gồm: cetylcholinesterase và Pseudocholinesterase huyết tương, dẫn đến sự tích tụ các cetylcholin tại các synap thần kinh. Trên lâm sàng thường gặp 3 hội chứng liên quan đến ngộ độc Phospho hữu cơ: hội chứng Muscarin, hội chứng Nicotin và hội chứng Thần kinh trung ương.
Phospho hữu cơ được hấp thụ vào cơ thể qua đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường da và niêm mạc.
NGUYÊN LÝ
Định tính Phospho hữu cơ có trong nước tiểu hoặc dịch rửa dạ dày bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography).
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để tách các chất trong hỗn hợp khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh (đã được đặt sẵn hỗn hợp cần tách). Pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxide, hoặc cellulose được phủ trên một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn. Trong quá trình di chuyển trên lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp phân tích di chuyển trên lớp mỏng, cùng chiều với pha động, với tốc độ khác nhau. Kết quả ta thu được 1 sắc ký đồ trên lớp mỏng.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Bác sỹ, cử nhân, được đào tạo kỹ thuật định tính Phospho hữu cơ bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC).
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện
Hệ thống chạy sắc ký lớp mỏng Nanomat 4 của hãng Camag
Bình chiết 250 mL
Đĩa Persi, cốc có mỏ
Bộ chấm mẫu
Giấy quỳ
Hóa chất
Pha tĩnh: Bản mỏng Silica gel (10 cm × 3 cm).
Pha động: Dung dịch (nHexan. ceton) theo tỷ lệ thể tích 4.1.
Dung dịch hiện màu PdCl2 0,25% / HCl 0,1N.
Dung môi chiết: Diethyl Ether, cồn tuyệt đối.
Dung dịch H2SO4 10%.
Dung dịch chuẩn. Thường dùng thuốc trừ sâu nhóm lân hữu cơ như Volphatox (Methyl Parathyon-MP), Thiophot (Parathion), Dipterex và DDVP (Dichlorvos, Vapona).
Người bệnh:
Người bệnh khoa Hồi sức cấp cứu nghi ngờ nhiễm độc Phospho hữu cơ.
Phiếu xét nghiệm: theo mẫu quy định của Bệnh viện và của Bộ Y tế, phải điền đầy đủ thông tin người bệnh…
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm:
Nước tiểu: 50 – 150 mL (tốt nhất 150mL)
Dịch rửa dạ dày: 50 – 150 mL
Lấy bệnh phẩm cho vào lọ sạch, đậy kín.
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết mẫu
Cho vào bình chiết mẫu 50 – 100mL nước tiểu hoặc dịch rửa dạ dày, 20-30mL Diethyl Ether, thêm một vài giọt H2SO4 10% (để đảm bảo môi trường là acid, có thể kiểm tra bằng giấy quỳ).
Lắc trộn đều dung dịch trong bình chiết. Sau đó để yên cho dung dịch phân thành 2 lớp, chiết lấy phần dung dịch phía trên.
Cho thêm vào bình chiết 1-5mL cồn tuyệt đối. Tiếp tục lắc nhẹ và đều dung dịch, để yên cho dung dịch tách thành 2 lớp, và chiết lấy phần dung dịch phía trên.
Cho dung dịch thu được ra đĩa Persi, đun trên bếp để bay hơi bớt dung môi.
Chấm mẫu và chạy sắc ký lớp mỏng
Đặt bản mỏng trên bàn chấm mẫu, cố định bản mỏng bằng nam châm. – Sử dụng kim chấm mẫu để lấy mẫu bệnh và mẫu đối chứng (chuẩn), sau đó tiến hành chấm lên bản mỏng. Sau khi chấm mẫu xong, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút (hoặc sấy khô nhiệt độ 40oC khoảng 1 phút).
Cho dung dịch chạy sắc ký nHexan- ceton (4:1) vào bình chạy mẫu (lớp dung dịch dày khoảng 1-5mm), đặt bản mỏng mới chấm vào bình và đậy nắp bình lại.
Lưu ý: phần chấm mẫu đặt phía dưới, tiếp xúc với dung môi chạy. Điểm chấm mẫu cách mặt dung môi khoảng 0,5-1cm.
Chờ cho dung môi chạy gần hết chiều dài của bản mỏng (cách mép trên khoảng 1cm), lấy bản mỏng ra và để khô ở nhiệt độ phòng (hoặc sấy khô).
Sử dụng thuốc hiện màu PdCl2 0,25% / HCl 0,1N phun đều lên bản mỏng.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
So sánh vết màu tạo ra trên bản mỏng (vết mẫu bệnh và vết mẫu chuẩn):
Dương tính: trên bản mỏng xuất hiện 2 vết có cùng màu vàng cam trên nền trắng và Rf của mẫu thử tương đương với Rf của mẫu chuẩn thì kết luận là có Phospho hữu cơ trong mẫu thử.
Rf: hệ số di chuyển, được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi Công thức tính:
Trong đó: Rf = a/b.
a (cm): khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử. b (cm): khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đi
của vết.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến l.
Âm tính: Trên bản mỏng chỉ xuất hiện 1 vết màu vàng cam của mẫu chuẩn thì kết luận không có Phospho hữu cơ trong bệnh phẩm.
SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Kết quả âm tính giả
Nguyên nhân:
Quá trình tách chiết chất cần phân tích chưa đúng
Chất cần phân tích bị biến đổi trong quá trình tách chiết, đặc biệt là bước đuổi dung môi trên bếp.
Chất cần phân tích bị rơi bớt theo phần dung môi cần loại bỏ
Cách xử trí:
Tiến hành làm lại xét nghiệm một cách cẩn trọng
Kết quả không xuất hiện vết màu cam trên bản mỏng
Nguyên nhân:
Dung dịch hiện màu bị hỏng
Dung dịch chuẩn bị hỏng
Cách xử trí:
Thay các dung dịch bị hỏng
Dương tính giả
Nguyên nhân:
Xử lý mẫu chưa đạt, còn tạp chất trong mẫu thử
Cách xử trí:
Tiến hành xử lý mẫu lại, cẩn thận hơn.
Xem lại dung dịch pha động.
