ĐỊNH NHÓM HLA ĐỘ PHÂN GIẢI CAO BẰNG KỸ THUẬT SSO – LUMINEX
(Performing high – resolution HLA typing by SSO Luminex Technique)
NGUYÊN LÝ
Dựa trên nguyên lý lai giữa đầu dò DNA với sản phẩm DNA của mẫu xét nghiệm đánh dấu bằng huỳnh quang, trong đó các đầu dò DNA được thiết kế đặc hiệu cho từng alen HLA ở độ phân giải cao (High resolution). Tùy theo mật độ huỳnh quang tương ứng, hệ thống Luminex đọc và xác định được tên đầu dò đã gắn với chuỗi DNA của mẫu và kiểu gen HLA tương ứng.
Nguồn gốc quy trình: theo quy trình kỹ thuật của Hiệp hội Ngân hàng máu Mỹ AABB và của hãng (1,2,3)
CHỈ ĐỊNH
Người bệnh ghép tế bào gốc tạo máu đồng loại, ghép cơ quan từ người cho;
Mẫu máu của người hiến mô và các cơ quan;
Các sản phẩm thu được từ người hiến tế bào gốc: máu ngoại vi, dịch tủy xương, máu dây rốn.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Người bệnh ghép tế bào gốc tự thân.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện Cán bộ được đào tạo để thực hiện kỹ thuật.
Phương tiện – Hóa chất
Phương tiện
Máy PCR, máy ủ nhiệt;
Hệ thống Luminex;
Máy ly tâm lạnh;
Máy trộn mẫu vortex;
Máy tính và phần mềm phân tích kết quả (LABScan);
Micro Pipet, đầu côn lọc, ống nghiệm 1,5 ml, hốt vô trùng;
Găng tay, mũ, khẩu trang.
Hóa chất
Kít PCR gồm khay 96 giếng hoặc ống nghiệm chạy PCR, mồi DNA (primer) đặc hiệu HLA, đệm D – mix;
Kít lai DNA chứa hạt nhựa gắn đầu dò (probe) đặc hiệu DNA đối với từng alen HLA, dung dịch streptavidin gắn huỳnh quang (SAPE), dung dịch đệm lai, đệm hồi tính, đệm biến tính, đệm rửa;
Taq polymerase;
Dung dịch sheath chạy máy;
Cồn 96o – 100oC;
Nước khử ion.
Mẫu bệnh phẩm
Mẫu DNA (nồng độ 20 – 200 ng/µl) đã tách từ bệnh phẩm máu ngoại vi, máu dây rốn, dịch tủy xương.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Khuếch đại mẫu DNA sau tách
Hút 2 µl DNA vào mỗi ống nghiệm hoặc giếng;
Trộn mồi DNA, dung dịch đệm D – mix và Taq polymerase theo tỷ lệ phù hợp, trộn đều;
Thêm 18µl hỗn hợp trên vào mỗi giếng hoặc ống nghiệm đã có DNA, đạt thể tích cuối cùng 20µl;
Đậy kín phiến hoặc ống nghiệm, chuyển vào máy và chạy PCR.
Lai sản phẩm DNA đã khuếch đại với hạt SSO
Biến tính và hồi tính:
Chuyển 5µl sản phẩm DNA khuếch đại vào mỗi giếng của phiến 96 giếng mới (số lượng giếng cần dùng tùy thuộc vào số locus cần xét nghiệm);
Thêm 2,5µl đệm biến tính vào mỗi giếng, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút;
Thêm 5µl đệm hồi tính, trộn đều;
Giữ phiến trong bể đá trước khi lai.
Lai với đầu dò DNA:
Trộn hạt nhựa gắn đầu dò DNA và đệm lai theo tỷ lệ phù hợp vào mỗi giếng của phiến đã xử lý, đậy chặt phiến, votex nhẹ;
Ủ phiến trong máy ủ nhiệt ở 60oC, trong 15 phút;
Thêm 100 µl đệm rửa vào mỗi giếng, đậy kín, ly tâm 1.000 – 1.300g trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi, lặp lại bước rửa 2 lần.
Đánh dấu và phân tích:
Hút 50 µl dung dịch SAPE 1X vào mỗi giếng, đậy phiến, trộn nhẹ;
Chuyển phiến vào máy ủ nhiệt, ủ phiến ở 60oC trong 5 phút;
Rửa phiến, chuyển vào hệ thống máy Luminex để đọc;
Chạy máy theo chương trình và phân tích kết quả dựa theo phần mềm đi kèm với kít.
Trả kết quả
Ghi kết quả vào phiếu xét nghiệm; sổ
Ký duyệt và kết quả cho bộ phận chỉ định;
Thu dọn dụng cụ, vệ sinh máy
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Heather Dunckley (2012). HLA typing by SSO and SSP methods.
Immunogenetics – Method in Molecular Biology, Volume 882, p 9 – 25.
Luminex (2008). Luminex 200 system user manual.
One Lambda (2008). LAB Type SSO typing test product insert, Canoga Park.
