NUÔI CẤY CỤM TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU
(Hematopoietic colony – forming cell assays)
NGUYÊN LÝ
Trong môi trường nuôi cấy có các chất kích thích phát triển thích hợp tế bào gốc sẽ phát triển thành các cụm biệt hóa của các dòng tế bào khác nhau. Dựa vào phương pháp này để đánh giá chất lượng khối tế bào gốc.
Nguồn gốc kỹ thuật: Theo quy trình kỹ thuật của AABB.
CHỈ ĐỊNH
Máu dây rốn;
Tế bào gốc máu ngoại vi;
Dịch tủy xương.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Người thực hiện: được đào tạo để thực hiện kỹ thuật.
Phương tiện – Hóa chất
Phương tiện:
Tủ an toàn sinh học;
Tủ nuôi cấy tế bào;
Kính hiển vi đảo ngược;
Máy trộn Votex; – Micro – pipet;
02 ống nghiệm 1ml;
06 đĩa Petri d=35mm; 02 đĩa Petri d=100mm;
40 ống nghiệm 10ml có nắp tiệt trùng;
01 kim Catheran; 01 bơm tiêm một lần 3ml, 02 kim 18G.
Hóa chất
Methycellulose (MethoCult GF H4434V);
Nước cất.
Mẫu bệnh phẩm
Mẫu tế bào gốc máu dây rốn, tế bào gốc tủy xương, tế bào gốc máu ngoại
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Nuôi cấy tế bào:
Giải đông lọ môi trường methycellulose;
Trộn kỹ mẫu máu trên máy votex;
Dùng micro – pipet hút mẫu máu theo theo thể tích:
+ Hút 2 µl nếu mật độ tế bào nuôi cấy
+ Hút 1 µl nếu mật độ tế bào nuôi cấy > 40 G/l.
Cho mẫu máu vừa hút vào ống chứa 2,5ml MethoCult GF H4434V:
Dùng bơm tiêm 1ml, kim 18G rút chính xác 1ml cho vào đĩa petri d=35mm. Xoay tròn đĩa để môi trường phủ đều khắp mặt đĩa petri;
Tiến hành tương tự với đĩa thứ 2;
Đặt 2 đĩa nuôi cấy vào trong đĩa petri d=100mm, đặt thêm một đĩa petri bỏ nắp d=35mm có khoảng 0,5ml nước cất;
Đậy nắp đĩa petri d=100mm, ghi mã số mẫu và ngày thực hiện;
Cho đĩa môi trường vào tủ nuôi cấy tế bào ở nhiệt độ 37oC, 5% CO2;
Ghi theo dõi: mã, thể tích, ngày cấy mẫu, ngày đọc kết quả…
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sau 14 ngày kể từ ngày cấy mẫu, lấy mẫu ra đọc kết quả.
Xác định và phân biệt các loại cụm tế bào:
BFU – e (Burst Forming Unit – erythocyte):
+ Số cụm hồng cầu từ 1 đến 2, hoặc bao gồm 8 đến 20 nguyên hồng cầu gọi là CFU – E.
+ Số cụm hồng cầu ≥ 3 cụm, trên 200 nguyên hồng cầu gọi là BFU – E.
CFU – GM (colony Forming Unit – Granulocyte/Macrophage): Một cụm bao gồm ≥ 40 bạch cầu hạt hoặc đại thực bào.
CFU – Mix (Colony Forming Unit – Mixed): Một cụm bao gồm hồng cầu trưởng thành và ≥ 20 bạch cầu hạt/đại thực bào/mẫu tiểu cầu
Đánh giá cụm dưới kính hiển vi quang học đảo ngược
|
Màu sắc tế bào |
Số lượng tế bào trong một cụm |
Đánh giá kết quả |
|
Duy nhất hồng cầu (màu đỏ) |
≥ 8 tế bào |
01 BFU – e |
|
|
Không đếm |
|
|
Duy nhất bạch cầu |
≥ 40 tế bào |
01 CFU – GM |
|
|
Không đếm |
|
|
Bạch cầu + Hồng cầu |
≥ 20 tế bào bạch cầu |
CFU – Mix |
|
|
BFU – E |
|
|
Các loại khác |
|
Không đếm |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Emer Clarke. Colony forming cell assays for determining potency of cellular therapy products. Cellular Therapy: Principle, Method and Regulation, Bethesda, MD: AABB, 2009, chapter 48, p.573 – 580.
