CÔNG THỨC NHIỄM SẮC THỂ MÁU NGOẠI VI
KARYOTYPING ANALYSIS OF PERIPHERAL BLOOD SAMPLE
NGUYÊN LÝ
Các tế bào lympho máu ngoại vi khi tiếp xúc với chất gây phân bào có khả năng chuyển dạng thành tế bào non và phân chia. Lợi dụng khả năng đó, người ta nuôi cấy máu ngoại vi trong môi trường có chất kích thích phân bào và sau đó làm ngừng phân bào ở kỳ giữa, giai đoạn có hình dạng nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể) điển hình, để làm tiêu bản quan sát nhiễm sắc thể. Phân tích nhiễm sắc thể tế bào máu ngoại vi cho phép chẩn đoán các hội chứng di truyền do bất thường nhiễm sắc thể, xác định nhiễm sắc thể giới của cá thể.
CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được cho tất cả người bệnh mắc bệnh máu ác tính hoặc nghi ngờ mắc bệnh lý di truyền bẩm sinh.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm di truyền đã được đào tạo làm kỹ thuật.
Phương tiện – hóa chất
Phương tiện
Ống falcon 50 ml vô trùng;
Chai nuôi cấy vô trùng;
Lam kính;
Giá để lam;
Ống falcon 15 ml;
Ống nghiệm thủy tinh;
Pipet Pasteur;
Ống eppendorf;
Ống chứa chất chống đông heparin sodium 5ml.
Hóa chất
Môi trường nuôi cấy tế bào (RPMI 1640 có L – glutamin, Hepes);
Huyết thanh bào thai bê (FBS);
PHA (phitohemagglutinin);
Kháng sinh: streptomycin 10mg/ml + penicilin 10.000UI/ml;
Dung dịch colcemide 0,01‰ (10µg/ml);
Dung dịch nhược trương: KCL 0,075M (pH=7,4);
Dung dịch đếm bạch cầu;
Methanol tuyệt đối; – Acid acetic.
Bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi được chứa trong ống có chất chống đông heparin sodium.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Nuôi cấy
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:
Cho 45ml môi trường nuôi cấy vào ống falcon 50ml, cho thêm 5ml huyết thanh bào thai bê và 500µl kháng sinh trộn kỹ.
Chuẩn bị chai nuôi cấy
Mỗi chai nuôi cấy ghi thông tin người bệnh, ngày cấy, ngày thu hoạch;
Trong mỗi chai nuôi cấy cho 10ml môi trường nuôi cấy.
Nuôi cấy tế bào
Cho 1ml máu ngoại vi, 200µl PHA vào chai nuôi cấy. Lắc nhẹ cho mẫu được trộn đều vào môi trường, nới lỏng nắp, đặt nằm trong tủ ấm 37oC, 5%CO2 trong 72 giờ.
Thu hoạch
Nhỏ colcemide: Sau 72 giờ, cho vào mỗi chai nuôi cấy 50 µl dung dịch colcemide 0,010/00 (10µg/ml), đặt lại chai nuôi cấy vào tủ ấm trong 50 phút.
Chuẩn bị hóa chất, dụng cụ:
Bật tủ ấm 37ºC, làm ấm chai dung dịch KCL 0,075M (Số lượng đủ 8ml cho một chai nuôi cấy).
Chuẩn bị dung dịch carnoy theo tỷ lệ: 3 methanol: 1 acid acetic.
Chuẩn bị ống falcon 15ml, ống nghiệm thủy tinh, pipet thủy tinh theo số lượng ống cấy.
Sau đó chuyển toàn bộ huyền dịch ở chai nuôi cấy vào ống falcon 15ml, ly tâm ở máy ly tâm ngang 1.000 vòng/phút trong 8 phút.
Sau khi ly tâm hút bỏ phần dịch nổi ở trên, để lại cặn tế bào (chỉ hút đến cách mặt trên cặn tế bào khoảng 5 mm).
Cho thêm vào ống ly tâm 8ml dung dịch nhược trương đã để ấm 37oC trước,trộn nhẹ một vài lần rồi ủ ở bể ấm 37oC trong 30 phút.
Sau khi ủ 30 phút cho thêm vào mỗi ống 0.5 – 1 ml dung dịch carnoy, trộn nhẹ để 5 – 10 phút.
Lấy ống ra ly tâm lấy cặn, hút bỏ dung dịch nổi phía trên cho thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch carnoy trộn đều để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút 2.8. Lặp lại bước 7 đến khi cặn trắng. Tái huyền dịch bằng dung dịch carnoy.
Nhỏ tiêu bản
Các lam kính sạch rửa sạch ngâm qua nước cất, ngâm lại vào cồn tuyệt đối, chuyển sang ngâm nước cất để lên giá lam cho khô;
Đặt giá lam vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 10 phút, sau đó lấy ra để nghiêng 20 – 30o trên giấy thấm;
Nhỏ một giọt huyền dịch lên lam kính. Chú ý khi nhỏ tiêu bản để đầu pipet cao hơn mặt lam kính từ 10 – 20 cm; – Để tiêu bản khô tự nhiên.
Lưu ý: Trong trường hợp còn huyền dịch thì lưu vào ống eppendorf để nhỏ lại lam khi cần.
Nhuộm Giêmsa
Pha Giêmsa 10% từ Giêmsa mẹ nhuộm lam 5 – 10 phút;
Rửa dưới vòi nước;
Sấy khô trong tủ sấy 60oC.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Tiêu bản sau khi nhuộm Giêmsa và nhuộm băng G, số lượng và cấu trúc của các cặp nhiễm sắc thể sẽ được khảo sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại
lần và được phân tích bằng phần mềm chuyên dụng.
Một số quy tắc trong khi phân tích:
Thừa nhiễm sắc thể: có từ 2 cụm phân bào trở lên thừa cùng 1 nhiễm sắc thể.
Thiếu nhiễm sắc thể: có từ 3 cụm phân bào trở lên thiếu cùng 1 nhiễm sắc thể.
Bất thường cấu trúc: có từ 2 cụm trở lên mang cùng 1 bất thường.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
|
Vấn đề |
Nguyên nhân |
Xử trí |
|
|
Nồng độ chất chống đông không |
Kiểm tra lại nồng độ chất chống đông. |
|
Không có cụm kỳ giữa (cụm mitose), ít cụm. |
đúng. |
|
|
Lấy sai chất chống đông, cho mẫu vào dung dịch chống đông: lithium heparin, EDTA, phenolheparin, natricitrat… |
Yêu cầu lấy lại mẫu nếu có thể. Nếu không thể lấy lại mẫu có thể rửa lại tế bào bằng môi trường nuôi cấy trước khi nuôi cấy. |
|
|
Chuyển mẫu và bảo quản mẫu |
Kiểm tra một số vấn đề: thời gian từ khi lấy mẫu tới khi nhận mẫu, nhiệt độ, áp suất, pH môi trường dùng lưu mẫu khi vận chuyển mẫu. |
|
|
Nhiệt độ , CO2 trong tủ nuôi cấy không đúng, quá cao hoặc quá thấp. |
Kiểm tra lại nhiệt độ, CO2 trong tủ ấm, nếu không đảm bảo phải mời kỹ sư điều chỉnh lại. |
|
|
Môi trường nuôi cấy không đầy đủ (L – glutamin không còn hoạt tính, giảm hoạt tính) |
Thêm L – glutamin mới. |
|
|
Huyết thanh không phù hợp (huyết thanh không hỗ trợ được cho sự phát triển của tế bào (huyết thanh mất hoạt tính) hoặc gây độc cho tế bào) |
Sử dụng lô huyết thanh khác, hoặc ống huyết thanh mới (các ống huyết thanh được tách ra từ chai to), loại huyết thanh khác (huyết thanh bào thai bê, huyết thanh bò, huyết thanh AB người). |
|
|
Sử dụng đồ thủy tinh (pipet thủy tinh, pipet Pasteur), đồ nhựa bị lỗi(chai nuôi cấy, đĩa petri)… |
Thử thay đổi sang loại pipet mới, chai nuôi cấy, đĩa petri mới. |
|
|
Màng tế bào không vỡ ra được |
Thời gian nhược trương không đủ, sai về nồng độ nhược trương. |
Rửa lại cặn tế bào bằng dung dịch carnoy tỷ lệ 2: 1. |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Margaret J. Barch, (1991), “The ACT Cytogenetics Laboratory Manual”, Raven press.
Phạm Quang Vinh, Đỗ Trung Phấn, (2009), “Kỹ thuật huyết học và truyền máu ứng dụng trong lâm sàng”,pp103 – 110, Nhà xuất bản Y học.
