Nguyên tắc
Xét nghiệm lai tại chỗ sử dụng mồi dò DNA gắn digoxigenin gắn chất mầu diaminobenzidin (DAB) nhằm xác định tình trạng khuyếch đại gen Her-2/neu.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện
Máy lai biến tính
Kính hiển vi quang học
Phiến kính, lá kính
Máy cắt lát mỏng
Lưỡi dao cắt lát mỏng
Tủ ấm 370 và 560
Tủ lạnh
Ống hút
Hóa chất
Ezprep khử parafin
Dung dịch CC2 khử parafin
Protease
Nước bạc
Dung dịch SIL ISH DNP CHRC
RED ISH DIG FR
RED ISH DIG FR
Thuốc nhuộm hematoxylin
Dung dịch Bluing
Bộ kít Her-2 và CEP17
Cồn (700, 800, 850, 900, 1000).
Xylen
Dung dịch rửa
Các bước tiến hành
Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan
Cài đặt chương trình cho máy
Dán nhãn và đặt phiến kính gắn mẫu mô đã cắt vào máy
Khử parafin bằng EZprep
Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2: 30 phút ở 900C
Xử lý protease: 16 phút
Ủ mảnh cắt với 100 µl probe Her-2 và CEP17 trong 4 phút
Biến tính DNA trong 20 phút ở 800C
Lai DNA trong 6 giờ ở 370C
Rửa bằng nước bạc trong 8 phút ở 720C
Ủ trong dung dịch SIL ISH DNP CHRC: 4 phút
Ủ với RED ISH DIG FR: 24 phút
Ủ với RED ISH DIG FR: 8 phút
Nhuộm hematoxylin II trong 4 phút
Nhuộm với dung dịch Bluing trong 4 phút
Lấy mảnh cắt ra khỏi máy và làm sạch mảnh cắt
Làm khô mảnh cắt trong 1 giờ ở 600C
Ngâm mảnh cắt trong xylen 3 phút x 2 lần
Gắn lá kính và đọc kết quả.
Kết quả
Đánh giá tỷ lệ Her-2/CEP17 bằng cách đếm tín hiệu Her-2 (màu đỏ) và tín hiệu NST17 (màu nâu vàng) trong 20 nhân tế bào ung thư xâm nhập.
Tỷ lệ Her-2/CEP17
Tỷ lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
Tỷ lệ 2,5
Tỷ lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
Tỷ lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17
Số lượng tín hiệu màu đỏ sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.
Những sai sót và hướng xử trí
|
KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Khử parafin không hết |
Tăng thời gian khử parafin hoặc thay thế EZREP mới |
|
Điều kiện lai không chính xác |
Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai hoặc buồng lai |
|
Nhiệt độ rửa sau khi lai không chính xác |
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa hoặc tăng thời gian lai |
|
Có bóng khí khi gắn lá kính |
Loại bỏ bóng khí trước khi đưa vào máy lai |
|
Không đủ dung dịch lai hoặc probe |
Tăng thêm lượng probe |
|
Digest không đủ |
Kiểm tra lại nhiệt độ digest hoặc tăng thêm thời gian digest |
|
Thời gian cố định quá dài |
Kiểm tra lại quy trình cố định bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định ngay sau mổ trong 6 – 48 giờ, hoặc có thể giảm bớt thời gian bộc lộ |
|
TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên bệnh phẩm |
-Tăng thêm thời gian cố định |
|
Probe phân bố không đều trên bệnh phẩm do có bọt khí |
-Thực hiện lại quá trình lai và đảm bảo không có bọt khí |
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn |
-Tăng thể tích dung dịch lai |
|
NHUỘM NỀN CAO (HIGH GROUND) |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Do quá trình rửa sau khi lai |
Kiểm tra lại pH của dung dịch rửa (7,2-7,5) Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa Lắc trong quá trình rửa Tăng thời gian rửa bằng SSC lên 5 phút Tăng thời gian rửa nghiêm ngặt sau lai Điều chỉnh thời gian nhuộm bằng H&E và Bluing |
|
MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Sấy tiêu bản không đúng |
-Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy (56oC) |
|
Bộc lộ quá mức |
Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ Giảm thời gian bộc lộ Giảm thời gian digest |
|
Biến tính quá mức |
Kiểm tra lại nhiệt độ biến tính Giảm thời gian biến tính |
|
Bệnh phẩm bị bong ra khi loại bỏ lá kính sau khi lai |
-Loại lá kính bằng cách ngâm tiêu bản sau lai vào dung dịch rửa và lắc đều |
