Nguyên tắc
Hoá mô miễn dịch (HMMD) là sự kết hợp của hai chuyên ngành miễn dịch học và mô học, trong đó có việc ứng dụng các nguyên lý và các kỹ thuật của miễn dịch học để nghiên cứu tế bào và mô. Kỹ thuật hoá mô miễn dịch được sử dụng không chỉ để xác định xem một mô có biểu hiện (hay không biểu hiện) một kháng nguyên riêng biệt mà còn xác định tình trạng kháng nguyên của các tế bào riêng biệt trong mô đó và vị trí của các kháng nguyên này trong cấu trúc tế bào. Hoá mô miễn dịch giúp chẩn đoán phân biệt về bản chất và nguồn gốc của tế bào, bản chất của mô u thông qua sự hiện diện của một số kháng nguyên đặc hiệu, đặc biệt trong trường hợp các mô kém biệt hoá hoặc không biệt hoá trên mô học. Trong một số trường hợp, HMMD giúp cho việc chẩn đoán phân biệt giữa u lành và u ác, chẳng hạn như sử dụng một số dấu ấn miễn dịch trong chẩn đoán phân biệt các u lympho ác tính với các tổn thương khác của hạch. Hoá mô miễn dịch còn giúp xác định các dấu hiệu của thành phần tế bào ở mức sinh học phân tử, qua đó người ta có thể tìm thấy mối liên quan giữa tình trạng của tế bào và mô với các rối loạn về quá trình phát triển như quá trình phát sinh, phát triển của mô ung thư (các dấu hiệu liên quan đến gen ung thư, yếu tố phát triển bì, yếu tố tăng sinh…) hoặc các rối loạn khác như rối loạn chuyển hoá, rối loạn do viêm, nhiễm trùng gây ra.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, ống hút tự động.
Kẹp không mấu, kéo.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Gắn lá kính bằng Resin nếu dùng DAB hoặc Geltol nếu dùng EAC
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Trang thiết bị:
Lò vi sóng hoặc nồi áp suất hoặc sử dụng proteinase K*.
Phiến kính có tráng chất gắn Silan (3-aminopropyltriethoxy-silane).
Phẩm nhuộm:
Dung dịch H2O2 3%.
Các kháng thể (dấu ấn) mua của các hãng cung cấp (theo bộ, kể cả chứng). Mỗi loại kháng thể có cách thức pha loãng khác nhau theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Hematoxylin để nhuộm nhân tế bào.
Pha dung dịch đệm:
Đệm TBS (tris buffer Saline) pH 7,2.
Dung dịch đệm citrat, pH 6,0.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 – 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định thhông thường từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ. Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Các mảnh cắt dày 3-4 µm, dán lên phiến kính đã được tráng Silan (3-aminopropyltriethoxy-silane).
Nhuộm hóa mô miễn dịch theo các bước như sau:
|
Sấy khô các phiến kính có lát cắt ở tủ ấm 370C |
: |
12 giờ (qua đêm) |
|
Khử parafin |
: |
10 phút |
|
Nhúng nước cất |
: |
5 phút |
Khử peroxidase nội sinh bằng dung dịch H2O2 3% : 5 phút
Rửa các phiến kính có lát cắt bằng nước cất : 5 phút
Bộc lộ kháng nguyên: bằng đun cách thuỷ trong nồi áp suất hoặc trong lò vi sóng hoặc sử dụng proteinase K*.
|
Rửa nước cất |
: |
5 phút |
|
Rửa các mảnh cắt bằng dung dịch TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút) |
: |
6 phút |
|
Ủ với kháng thể thứ nhất (primary antibody) |
: |
60 phút |
|
Rửa bằng dung dịch TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút) |
: |
6 phút |
|
Ủ với kháng thể thứ hai có gắn với biotin (Biotinylated secondary antibody) |
: |
30 phút |
|
Rửa bằng dung dịch TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút) |
: |
6 phút |
|
Ủ với phức hợp ABC hoặc streptavidin peroxidase |
: |
30 phút |
|
Rửa phiến kính có lát cắt bằng dung dịch TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút) Phủ dung dịch tạo màu DAB (Diamino benzidin) |
: |
6 phút |
|
hoặc EAC (3-amino-9-ethylcarbazole) |
: |
10 phút |
|
Rửa phiến kính có lát cắt bằng dung dịch TBS (Qua 2 bể, mỗi bể 3 phút) |
: |
6 phút |
|
Nhuộm nhân: bằng Hematoxylin |
: |
1 phút |
Rửa nước chảy:
Nếu dùng DAB thì tiếp tục khử nước.
Khử nước bằng cồn, rồi qua xylen
Gắn lá kính bằng Resin nếu dùng DAB hoặc Geltol nếu dùng EAC.
Kết quả
Dương tính: có sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể trên tế bào và mô, được hiển thị bằng màu vàng nâu (nếu dùng DAB) hoặc màu đỏ (nếu dùng EAC).
Âm tính: không có sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên – kháng thể trên tế bào và mô, không được hiển thị bằng màu vàng nâu (nếu dùng DAB) hoặc màu đỏ (nếu dùng EAC).
Nhân tế bào bắt màu xanh tím của Hematoxylin.
Kiểm tra chất lượng:
Trong khi tiến hành nhuộm HMMD, việc kiểm tra chất lượng là hết sức quan trọng, để đảm bảo loại trừ các khả năng dương tính giả và âm tính giả. Phải có các mảnh cắt chứng dương tính và âm tính được nhuộm kèm theo.
Những sai sót và hướng xử trí
Nếu bệnh phẩm không được cố định trong dung dịch formol đệm trung tính 10% thì khả năng bộc lộ kháng nguyên rất thấp.
Thời gian cố định quá lâu có thể làm mất tính kháng nguyên của mô, do đó, thời gian cố định tối đa là 6 giờ (bệnh phẩm sinh thiết nhỏ), 48 giờ (bệnh phẩm lớn).
Cần pha kháng thể theo hướng dẫn của nhà sản xuất, tìm một nồng độ thích hợp nhất để tránh âm tính giả hoặc dương tính giả.
Luôn kiểm tra hạn sử dụng của các kháng thể, nhất là với các kháng thể đã sử dụng còn dư từ lần nhuộm trước.
Tuân thủ quy trình kiểm tra chất lượng.
