Nguyên tắc
Photphatase kiềm thường có mặt ở màng tế bào của mô thận cũng như nhiều mô khác của cơ thể. Enzym thủy phân cơ chất sodium α- naphthyl photphat để sinh ra α- naphthol không hòa tan. Sản phẩm phản ứng đầu tiên này sẽ liên kết với muối diazonium thích hợp (fast red TR) để tạo ra màu đỏ của phẩm azo không hòa tan, đồng thời chúng đọng lại tại vị trí enzym. Như vậy, qua màu sắc của phẩm nhuộm, người ta biết được vị trí và mức độ hoạt động của enzym cần nghiên cứu.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Phương tiện, hoá chất
Máy cắt lạnh đã ở trạng thái sẵn sàng hoạt động
Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng
Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm
Phiến kính, lá kính sạch
Bút chì mềm (để ghi tên tuổi người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).
Giấy thấm, gạc sạch
Găng tay, khẩu trang, mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.
Chổi lông mềm
Gel cắt lạnh
Gắn lá kính: thạch glycerin
Cồn tuyệt đối
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.4.1 dưới đây), bao gồm: sodium α- naphthyl photphat, đệm Tris, fast red TR.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị
Bệnh phẩm sau khi lấy ra từ người bệnh được gửi ngay đến khoa giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.
Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi các thông tin về người bệnh vào sổ đăng ký và mã số người bệnh.
Ghi mã số của người bệnh vào phiến kính và dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm.
Cắt lọc bệnh phẩm
Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ về loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… của bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.
Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi do tác động cơ học.
Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô.
Dùng dao sắc cắt theo một hướng, sao cho đường cắt gọn, không bị dập nát
Kích thước của mảnh mô được cắt tùy theo kích thước của vật gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 x 1 x 0,2cm.
Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp.
Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh mô
Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh (Cryobar) trong buồng làm lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng (có màu trắng).
Mẫu mô sau khi đã đông cứng được cắt thành những lát thật mỏng. Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng. Sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt từ 2-5 micromet. Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải.
Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.
Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô và tế bào giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm) sau khi lát cắt được dàn lên phiến kính, phải được cố định ngay bằng cồn tuyệt đối 95-960 hoặc cồn acetic-formol trong 20 giây.
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Chuẩn bị môi trường ủ
Sodium α- naphthyl photphat: 10 mg
0,2 M đệm Tris (dd A lưu trữ) pH 10: 10 ml
Muối diazonium (fast red TR): 10 mg
pH cuối cùng của môi trường ủ phải trong khoảng 9,0 – 9,4.
Tiến hành kỹ thuật
Ủ mảnh cắt lạnh trong môi trường ủ ở 37 ºC, khoảng 15 – 60 phút
Rửa bằng nước cất
Nhuộm đối màu bằng xanh metyl 2%
Rửa dưới vòi nước chảy
Gắn lá kính bằng thạch glycerin
Kết quả
Hoạt tính của photphatase kiềm: nâu hơi đỏ
Nhân: xanh
Những sai sót và hướng xử trí
pH cuối cùng của dung dịch ủ phải đạt khoảng 9,2. Nếu sử dụng mảnh cắt parafin, thời gian ủ cần kéo dài hơn.
