Nhuộm phát hiện adenosin triphosphatase (atpase) 

Nguyên tắc

Phản ứng ATPase là kỹ thuật ngấm bạc được Wachstein và cộng sự mô tả lần đầu năm 1960. Enzym này có thể tạo ra photphat từ cơ chất adenosin triphotphat (ATP). Trong phương pháp chì của Wachstein, ion photphat được giải phóng sẽ kết hợp với ion chì để tạo chất tủa là chì photphat. Chất tủa này có khả năng biến đổi thành chì sunfit khi được xử lý bằng ammonium sunfit hòa tan. Chất này sẽ tạo tủa màu đen hoặc nâu sẫm tại vị trí có enzym hoạt động. ATP cũng có thể được phát hiện bằng kỹ thuật ngấm kim loại tương tự phương pháp calcium – cobalt được Gomori mô tả giống kỹ thuật phát hiện photphatase kiềm. Kỹ thuật này thường được sử dụng để nhuộm các bệnh phẩm sinh thiết cơ xương. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học:                                   01

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học:                      01

Phương tiện, hoá chất 

Máy cắt lạnh đã ở trạng thái sẵn sàng hoạt động

Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng

Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm

Phiến kính, lá kính sạch

-Bút chì mềm (để ghi tên tuổi người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).

Giấy thấm, gạc sạch

Găng tay, khẩu trang, mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.

Chổi lông mềm

Gel cắt lạnh

Gắn lá kính: bằng thạch glicerin hoặc DPX.

Cồn tuyệt đối 

Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.4.1 dưới đây), gồm: ATP, cobalt – chlorit, ammonium sunfit, đệm glycin 0,1 M, đệm glycin 0,1M với CaCl₂ 0,75M, đệm veronal-acetat 0,1M pH 4,2 và pH 4,6; NaOH 0,1M; HCl 0,1M, hematoxylin Harris. 

Các bước tiến hành

Chuẩn bị

Bệnh phẩm sau khi lấy ra từ BN được gửi ngay đến khoa giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.

Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi các thông tin về người bệnh vào sổ đăng ký và mã số người bệnh.

Ghi mã số của người bệnh vào phiến kính và dán mã số vào hộp đựng bệnh phẩm.

Cắt lọc bệnh phẩm

Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ về loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… của bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.

Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi do tác động cơ học.

Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô.

Dùng dao sắc cắt theo một hướng, sao cho đường cắt gọn, không bị dập nát

Kích thước của mảnh mô được cắt tùy theo kích thước của vật gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 x 1 x 0,2cm. 

Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp.

Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh mô

Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh (Cryobar) trong buồng làm lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng (có màu trắng).

Mẫu mô sau khi đã đông cứng được cắt thành những lát thật mỏng. Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng. Sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt từ 2-5 micromet. Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải. 

Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.

Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô và tế bào giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm), sau khi lát cắt được dàn lên phiến kính, phải được cố định ngay bằng cồn tuyệt đối 95-96⁰ hoặc cồn acetic-formol trong 20 giây.

Nhuộm mảnh cắt

Chuẩn bị phẩm nhuộm 

Đệm glycin 0,1 M

Glycin: NaCl: Nước cất:

0,75g 0,585g 100ml

Đệm glycin 0,1M với CaCl2 0,75M

Đệm glycin 0,1M (dung dịch A):                                                    50ml

CaCl₂ 0,75M (11,03g CaCl₂/2H₂0 pha trong 100ml nước cất):                       10ml

Trộn lẫn, sau đó cho thêm khoảng 22ml NaOH 0,1M cho tới khi pH = 9,4

Dung dịch đệm veronal-acetat 0,1M, pH 4,2 và pH 4,6

Dung dịch ủ

ATP:   5mg

Dung dịch B:            10ml

Thêm NaOH 0,1M hoặc HCl 0,1M cho tới pH = 9,4

Tiến hành nhuộm

Trường hợp nhuộm với pH 9,4:

Ủ mảnh cắt lạnh trong dung dịch ủ (d) ở 37°C

Rửa kỹ trong nước cất

Nhúng trong cobalt-chlorit 2% trong 5 phút

Rửa kỹ dưới vòi nước chảy, sau đó tráng 3 lần nước cất.

Nhúng trong dung dịch ammonium sunfit pha loãng 1:10 trong 30 giây (trong tủ hốt).

Rửa kỹ dưới vòi nước chảy.

Nhuộm nhanh trong hematoxylin Harris.

Gắn bằng thạch glixerin hoặc khử nước, làm trong và gắn DPX.

Trường hợp nhuộm với pH 4,2 – 4,6:

Mảnh cắt lạnh được xử lý trước khi ủ bằng đệm veronal – acetat 0,1 M ở 4°C trong 10 phút

Rửa nhanh trong nước cất. 

Ủ mảnh cắt lạnh trong dung dịch ủ (d) ở 37°C

Rửa kỹ trong nước cất

Nhúng trong cobalt chlorit 2% trong 5 phút

Rửa kỹ dưới vòi nước chảy sau đó tráng 3 lần nước cất.

Nhúng trong dung dịch ammonium sunfit pha loãng 1:10 trong 30 giây (trong tủ hốt).

Rửa kỹ dưới vòi nước chảy.

Nhuộm nhanh trong hematoxylin Harris.

Gắn bằng thạch glycerin hoặc khử nước, làm trong và gắn DPX.

Kết quả

Typ sợi cơ	ATPase pH 4,2	ATPase pH 4,6	ATPase pH 9,4	NADH diaphorase SDH và LDH	Phosphorylase
Typ 1 Typ 2A Typ 2B Typ 2C	+++     +	+++ – +++ +++	+ +++ +++ +++	+++ ++ + ++	+/- +++ +++ +++

Những sai sót và hướng xử trí

Chỉ trong trường hợp pH 4,2, mảnh cắt mới cần nhuộm đối màu trong hematoxylin. 

Mảnh cắt phải được rửa rất kỹ sau bước cobalt – chlorit và ammonium sunfit để tránh hiện tượng dương tính giả.