Nhuộm lipid trung tính và aci bằng sunfat xanh lơ nil (theo cain)

Nguyên tắc

Nhuộm để phân biệt giữa các lipid trung tính và acid bằng một thuốc nhuộm phức tạp (Sunfat xanh lơ Nil). Thuốc nhuộm này có lysochrom, đỏ Nil, nhuộm màu hồng các lipid ở trạng thái lỏng, ngoài ra còn có một chất màu base, xanh lơ Nil nhuộm những thể có phản ứng acid.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học:                                   01.

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học:                      01

Phương tiện, hoá chất 

Máy cắt lạnh đã ở trạng thái sẵn sàng hoạt động

Dao sắc, thớt nhựa sạch, phẳng

Bộ dụng cụ phẫu tích bệnh phẩm

Phiến kính, lá kính sạch

Bút chì mềm (để ghi tên tuổi người bệnh, mã số tiêu bản trên phiến kính).

Giấy thấm, gạc sạch

Găng tay, khẩu trang, mũ, kính bảo vệ mắt và quần áo bảo hộ.

Chổi lông mềm

Gel cắt lạnh

Gắn lá kính: glycerogel hoặc sirô Apathy.

Cồn tuyệt đối 

Phẩm nhuộm sulphat xanh lơ Nil, Kernechtrol. 

Các bước tiến hành

Chuẩn bị

Bệnh phẩm sau khi lấy ra từ người bệnh được gửi ngay đến khoa giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học.

Kỹ thuật viên tiếp nhận, ghi các thông tin về người bệnh vào sổ đăng ký và mã số Người bệnh.

Ghi mã số của người bệnh vào phiến kính và dán mã số vào hộp đựng  bệnh phẩm.

Cắt lọc bệnh phẩm

Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học quan sát bệnh phẩm, mô tả kỹ về loại bệnh phẩm, số lượng, đo kích thước, màu sắc, tính chất, mặt cắt… của bệnh phẩm, xác định vùng tổn thương cần lấy mẫu cắt lạnh.

Động tác lấy bệnh phẩm phải nhẹ nhàng, tránh gây dập nát hay biến đổi do tác động cơ học.

Không kẹp vào vùng định lấy mẫu xét nghiệm, không rửa mẫu mô.

Dùng dao sắc cắt theo một hướng, sao cho đường cắt gọn, không bị dập nát

Kích thước của mảnh mô được cắt tùy theo kích thước của vật gá mẫu bệnh phẩm của máy cắt lạnh, thông thường kích thước 1 x 1 x 0,2cm. 

Số lượng mảnh cắt tuỳ từng trường hợp.

Làm lạnh mẫu bệnh phẩm và cắt mảnh mô

Đặt mẫu bệnh phẩm vào gá đúc lạnh rồi đưa ngay vào vị trí tương ứng trên thanh làm lạnh (Cryobar) trong buồng làm lạnh của máy, phủ gel cắt lạnh, xoay khối Head tracter đặt lên trên khuôn đúc chứa bệnh phẩm rồi đóng kín cửa kính phía trên buồng máy, chờ cho đến khi khối bệnh phẩm đông cứng (có màu trắng).

Mẫu mô sau khi đã đông cứng được cắt thành những lát thật mỏng. Bắt đầu cắt thô với độ dày từ 10-15 micromet để tạo mặt phẳng. Sau đó điều chỉnh độ dày lát cắt, cắt thành các mảnh có độ dầy 10µ. Quay máy cắt với nhịp độ vừa phải. 

Kết hợp với chổi lông mềm dàn mảnh mô lên phiến kính.

Cố định mảnh mô: (để cấu trúc mô và tế bào giữ nguyên hình dáng và bắt màu thuốc nhuộm), sau khi lát cắt được dàn lên phiến kính, phải được cố định ngay bằng cồn tuyệt đối 95-96⁰ hoặc cồn acetic-formol trong 20 giây và nhúng vào nước cất. Cắt 3 mảnh cắt.

Nhuộm mảnh cắt 

Mảnh cắt thứ nhất dùng để kiểm tra đặc tính lipid của những chất nghiên cứu: Nhuộm đơn giản bằng đen Soudan B trong dung môi cồn hoặc trong diacetin.

Hai mảnh cắt khác được xử lý như sau:

Chuyển hai mảnh cắt 2 và 3 vào trong dung dịch nước xanh lơ Nil 1% ở 60⁰C, trong 5 phút.

Nhuộm lại mảnh cắt 3 trong dung dịch xanh lơ Nil 0,02%, ở 60⁰C, trong 5 phút.

Nhuộm nhanh cả hai mảnh cắt trong nước ở 60⁰C.

Biệt hoá các mảnh cắt trong acid acetic 1%, ở 60⁰ C, trong 30 giây

Rửa sạch.

Gắn lá kính cho các mảnh cắt bằng glycerogel.

Kết quả

Tính chất lipid của các chất nghiên cứu đã được xác định do nhuộm Đen Soudan B:

Các lipid acid bắt màu xanh của xanh lơ Nil

Các lipid trung tính bắt màu hồng 

Sự bắt màu phải giống hệt nhau trên cả hai mảnh cắt, các lipid phải nhuộm được cả ở dung dịch 0,02% cũng như ở dung dịch 1%.