Nguyên tắc
Kháng nguyên virus viêm gan B gồm 2 thành phần là kháng nguyên lõi (HBcAg) có bản chất DNA và kháng nguyên bề mặt (HBsAg) có bản chất lipoprotein. Thông thường, orcein sẽ nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần xistin của HBsAg; nhờ vậy, người ta có thể phát hiện được sự có mặt của virus trong tế bào gan.
Kỹ thuật orcein cải biên theo Shikata có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn một số kỹ thuật orcein thông thường, đồng thời giá thành rẻ, dễ thực hiện và lợi thế của kỹ thuật là có thể thực hiện được kể cả khi mô gan đã được vùi parafin, thậm chí đã lưu trữ rất lâu, mặc dù hiện nay, cơ chế của hiện tượng nhuộm vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Eukitt gắn lá kính.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Dung dịch oxalic acid 2%.
Dung dịch cồn 70% – HCl.
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): Permanganat kali, acid sunfuric đậm đặc, Orcein, HCl đậm đặc.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 – 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Hỗn hợp dung dịch (A)
Dung dịch nước permanganat kali 0,5%: 95ml
Acid sunfuric đậm đặc: 5ml Chú ý: chuẩn bị dung dịch trước khi dùng.
Dung dịch cồn – orcein (B)
Orcein: 1g
Cồn etylic 70%: 100ml
HCl đậm đặc: 2ml
Tiến hành kỹ thuật
Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút.
Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút.
Rửa nước.
Oxy hóa trong dung dịch (A): 5 phút.
Rửa nước
Làm mất màu trong oxalic acid 2%
Rửa bằng nước cất, sau đó rửa nước chảy 3 phút
Nhuộm màu bằng dung dịch orcein (B): 2 – 4 giờ
Rửa nước
Biệt hóa trong dung dịch cồn 70% – HCl.
Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối.
Làm trong bằng 3 bể toluen sạch.
Gắn lá kính bằng Eukitt.
Kết quả
Bào tương tế bào gan nhiễm virus viêm gan B: dạng thủy tinh mờ.
Những sai sót và hướng xử trí
Ở bước 6, thời gian tẩy trắng mô chỉ kéo dài nếu cần thiết. Nói chung, chỉ vào khoảng 1 giây.
Ở bước 8, mảnh cắt được nhuộm màu tăng dần bằng dung dịch orcein và kiểm tra đậm độ màu sắc bằng kinh hiển vi quang học.
