Nguyên tắc
Fucsin basic và para andehit sẽ tạo thành phẩm nhuộm màu đỏ tía khi có mặt của acid vô cơ. Phẩm này được gọi là “andehit fucsin”, có khả năng nhuộm sợi chun, dưỡng bào, tế bào B của tụy nội tiết. Khi có mặt acid clohydric, para andehit sẽ giải trùng hợp tạo thành acetandehit và bị ngưng tụ lại khi gặp nhóm amino tự do của fucsin basic để tạo thành base Schiff (azomethine). Phản ứng andehit fucsin với các thành phần mô là do liên kết cộng hóa trị hoặc liên kết tĩnh điện. Khả năng nhuộm rất mạnh cho các mô anion, chẳng hạn như mô có chứa gốc sunfonat tự do là do cơ chế ion. Hiện nay, cơ chế nhuộm sợi chun hoặc tế bào B của tụy nội tiết vẫn còn chưa sáng tỏ.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Tủ ấm 370 và 560.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Dung dịch permanganat kali 1%.
Dung dịch acid oxalic 1%.
Thuốc nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): fucsin basic, para andehit, acid clohydric.
Thuốc nhuộm hoặc eosin hoặc van Gieson hoặc đỏ trung tính.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Hoà tan 1g fucsin basic trong 100 ml etanol 70%. Hâm nóng để làm tăng tốc độ phản ứng. Sau khi làm lạnh và lọc, thêm 1ml acid clohydric đậm đặc và 2 ml para andehit. Để ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày nhằm hoàn thiện quá trình chín (dấu hiệu chín: dung dịch chuyển từ màu đỏ sang đỏ tía). Có thể làm giảm thời gian chín bằng cách tăng nhiệt độ tới 50o-60°C. Sau khi dung dịch chín, lưu trữ bằng cách để trong tủ lạnh.
Khả năng nhuộm tốt nhất của aldehyde fucsin vào khoảng 2-4 ngày sau khi chuẩn bị dung dịch. Tuy nhiên, nếu để lưu trữ trong lạnh 4oC, dung dịch vẫn có thể hoạt động tốt trong vài tuần.
Tiến hành kỹ thuật
Tẩy parafin các mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
Rửa trong nước cất 3- 5 phút
Oxy hoá trong permanganat kali 1% x 5 phút.
Rửa dưới vòi nước chảy.
Loại permanganat kali bằng dung dịch acid oxalic 1%.
Rửa dưới vòi nước chảy.
Rửa trong etanol 70o.
Đặt mảnh cắt vào trong bể (lọ) đựng andehit fucsin được đậy kín x 15 phút.
Rửa kỹ trong etanol 70o.
Rửa dưới vòi nước chảy.
Nhuộm tương phản (đối màu) theo ý muốn (hoặc eosin, hoặc van Gieson, hoặc đỏ trung tính).
Khử nước bằng cồn 95o và 100°.
Làm trong bằng 3 bể toluen sạch.
Gắn lá kính.
Kết quả
Sợi chun: xanh da trời – tía đỏ.
Kỹ thuật này cũng được sử dụng để nhuộm phát hiện các hạt trong tế bào Beta của tuỵ, một số chất nhầy, nấm, chất cơ bản sụn.
Những sai sót và hướng xử trí
Độ tương phản giữa các sợi chun mảnh với sợi keo không được rõ ràng, nếu nhuộm đối màu bằng van Gieson. Tuy nhiên, nếu chỉ dùng để đối màu cho nhân thì vẫn thích hợp khi dùng van Gieson.
