Nội dung

Dengue virus igm miễn dịch bán tự động

 

Mục đích và nguyên lý 

Mục đích

Phát hiện kháng thể IgM kháng virus dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương.

Nguyên lý

Phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu kháng virus dengue dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA (miễn dịch gắn enzyme) (VD).  

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Dàn máy ELISA. 

Máy ly tâm. 

Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.

Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc – 70ºC) (nếu có).

Micropipette đơn kênh thể tích từ 10 µl đến 1000 µl.

Bộ pipetman 8 kênh (nếu có).

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 01 mẫu/lần.

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Bông

Kg

0,001

2

Dây garô

Cái

0,001

3

Tube đựng bệnh phẩm

Cái

1,000

4

Sinh phẩm chẩn đoán**

Test

16,000

5

Chứng ngoại kiểm âm (nếu có)

ml

0,100

6

Chứng ngoại kiểm dương (nếu có)

ml

0,100

7

Ngoại kiểm (nếu có)*

 

0.020

8

Đầu côn 1000 µl

Cái

3,000

9

Đầu côn 200 µl

Cái

5,000

10

Giấy thấm

Cuộn

0,100

11

Giấy xét nghiệm

Tờ

2,000

12

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Tờ

0,001

13

Bút viết kính

Cái

0,020

14

Bút bi

Cái

0,010

15

Cái

0,020

16

Khẩu trang

Cái

0,020

17

Găng tay

Đôi

0,100

18

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0,020

19

Quần áo bảo hộ

Bộ

0,005

20

Dung dịch nước rửa tay

ml

8,000

21

Dung dịch nước rửa tay

ml

1,000

22

Dung dịch khử trùng

ml

10,000

23

Khăn lau tay

Cái

0,010

 Ghi chú: 

* Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

** Nếu chỉ làm 01 mẫu vẫn phải mở 01 lọ kháng nguyên đủ cho 16 giếng bao gồm 11 mẫu bệnh phẩm + 5 mẫu chứng. Vì vậy nếu làm đơn lẻ 01 mẫu thì 01 bệnh phẩm phải chịu chi phí cho 15 giếng còn lại.

Bệnh phẩm

Huyết thanh hoặc huyết tương. 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: xem chi tiết phụ lục 2.

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: xem chi tiết phụ lục 6.

Tiến hành kỹ thuật 

Bộ sinh phẩm Dengue Duo IgM capture ELISA – Pan Bio (VD).

Các bước

Xét nghiệm định tính dengue IgM

2.1

Để Số lượng sinh phẩm cần dùng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi làm xét nghiệm.

2.2

Đánh số, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo thứ tự. 

2.3

Chuẩn bị dung dịch rửa.

2.4

Pha loãng kháng nguyên. 

2.5

Pha loãng huyết thanh người bệnh, chứng âm, chứng dương và chứng  cut-off. 

2.6

Trộn đều lượng kháng nguyên đã được pha loãng với một lượng tương đương Mab Tracer. Phức hợp Antigen – Mab Tracer để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.

2.7

Cho chứng âm, chứng dương, chứng cut-off và bệnh phẩm đã pha loãng vào các giếng của phiến nhựa theo thứ tự hướng dẫn của quy trình. 

2.8

Đậy phiến nhựa và ủ. 

2.9

Rửa phiến nhựa. 

2.10

Lắc nhẹ phức hợp Antigen – Mab Tracer. Nhỏ phức hợp này vào mỗi giếng. 

2.11

Đậy phiến nhựa và ủ. 

2.12

Rửa phiến nhựa. 

2.13

Nhỏ dung dịch hiện màu  vào mỗi giếng. 

2.14

Ủ phiến nhựa, không đậy và tránh ánh sáng.

2.15

Nhỏ dung dịch dừng phản ứng.

2.16

Đọc độ kết quả ở bước sóng 450 và 620nm trong vòng 30 phút sau khi dừng phản ứng.

Nhận định kết quả

Kết quả được tính theo Đơn vị PanBio như sau:

Tính giá trị trung bình của ngưỡng (calibrator) rồi nhân với yếu tố ngưỡng (calibration factor = 0,62). Đây chính là giá trị ngưỡng:

                       ODCO1 + ODCO2+ ODCO3

CO = 0,62  x  _________________________                

                                          3

                                         OD bệnh phẩm

Đơn vị Panbio  = 10  x   __________________

                                       OD giá trị ngưỡng

ﻣ Đơn vị PanBio

ﻣ Đơn vị PanBio = 9 – 11: Mẫu thử phải xét nghiệm lại.

ﻣ Đơn vị PanBio > 11: Mẫu thử dương tính, trong huyết thanh người bệnh có kháng thể IgM.

Những sai sót và xử trí

Sai sót

Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do: 

Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn. 

Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao.

Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxid hoá (thuốc tẩy, ion kim loại v.v…). 

Dung dịch dừng phản ứng bị nhiễm bẩn.

Xử trí

Tuân thủ đúng các bước quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.

Kiểm tra và vệ sinh máy rửa thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm.

Chia hóa chất (chất cộng hợp, dung dịch hiện màu và dừng phản ứng) vào ống nghiệm sạch trước mỗi lần nhỏ.