Nội dung

Dengue virus serotype pcr

 

Mục đích và nguyên lý

Mục đích 

Phát hiện DNA đặc trưng của virus dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương ở người. 

Nguyên lý 

Xác định serotype của virus dengue dựa trên nguyên lý của kỹ thuật onestep RT-PCR. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Máy PCR.

Bộ lưu điện.

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Máy ủ nhiệt.

Máy vortex.

Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.

Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).

Micropipette các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Bông

Kg

0.001

2

Dây garô

Cái

0.001

3

Cồn

ml

1.000

4

Bơm kim tiêm

Cái

1.000

5

Panh

Cái

0.0001

6

Khay đựng bệnh phẩm

Cái

0.0001

7

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Cái

0.001

8

Tube đựng bệnh phẩm

Cái

1.000

9

Sinh phẩm chẩn đoán

Test

1.000

10

Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng

Test

1.000

11

Kit tách RNA

Test

2.000

12

ống Falcol 50 ml

Cái

0.010

13

Eppendorf 1,7 ml

Tube

2.000

14

Eppendorf 0,2 ml

Tube

2.000

15

Đầu côn 10 µl có lọc

Cái

2.000

16

Đầu côn 30 µl

Cái

1.200

17

Đầu côn 200 µl có lọc

Cái

5.200

18

Đầu côn 1 ml có lọc

Cái

3.200

19

Ethanol BDH

ml

2.000

20

Water-DEPC Treated

ml

1.000

21

Thạch

Gam

0.075

22

Ladder 

ml

0.0025

23

Blue Juice Gel loading dye

ml

0.003

24

Ethidium Bromide

ml

0.1

25

TAE Buffer

ml

0.1

26

Giấy thấm

Cuộn

0.100

27

Giấy xét nghiệm

Tờ

2.000

28

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Tờ

0.001

29

Bút viết kính

Cái

0.020

30

Bút bi

Cái

0.010

31

Cái

0.020

32

Khẩu trang

Cái

0.020

33

Găng không có bột tal 

Đôi

0.500

34

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0.020

35

Quần áo bảo hộ

Bộ

0.005

36

Dung dịch nước rửa tay

ml

8.000

37

Cồn sát trùng tay nhanh

ml

1.000

38

Dung dịch khử trùng

ml

10.000

39

Khăn lau tay

Cái

0.010

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm)..

Bệnh phẩm

Huyết thanh hoặc huyết tương chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 2.

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ kit one-step RT-PCR định type virus dengue (VD).

Tách chiết RNA tổng số.

Thực hiện phản ứng RT-PCR. 

Điện di và phát hiện sản phẩm.

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng 

Chứng dương có ít nhất một trong các vạch sản phẩm tương ứng với các type của virus dengue như sau:  

Virus Dengue type 1: 482 cặp bazơ.  

Virus Dengue type 2: 119 cặp bazơ. 

Virus Dengue type 3: 290 cặp bazơ.  

Virus Dengue type 4: 392 cặp bazơ.

Chứng âm không có các vạch sản phẩm trên.

Phân tích mẫu

Dựa vào độ dài dải băng để kết luận type virus dengue gây bệnh: những mẫu có vạch sản phẩm PCR tương ứng với 1 trong 4 type trên thì kết luận dương tính với virus dengue type đó.

Những mẫu không có vạch sản phẩm nào thì kết luận không tìm thấy virus dengue.  

Những sai sót và xử trí

Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, chứng nội cũng không lên cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết RNA tổng số, chất lượng sinh phẩm, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.