Nội dung

Hcv genotype giải trình tự gene

HCV genotype giải trình tự gene

 

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Xác định genotype của HCV. 

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự nucleotide trên gen đặc trưng của virus viêm gan C.   

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn Sinh học cấp 2.

Máy PCR. 

Máy đọc điện di.

Máy giải trình tự gen.

Máy ly tâm 25000 x g.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.

Máy ủ nhiệt.

Máy vortex.

Micropipette.

Bộ lưu điện.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 3 mẫu/lần thực hiện (VD).

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Bông 

kg

0,001

2

Cồn

ml

1,000

3

Bơm kim tiêm

Cái

1,000

4

Panh

Cái

0,0001

5

Khay đựng bệnh phẩm

Cái

0,0001

6

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Test

0,001

7

Tube đựng bệnh phẩm

Cái

2,000

8

Găng không có bột (DNase-RNase free)

Cái

0,500

9

Sinh phẩm chẩn đoán

Test

1,000

10

Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra chất lượng

Test

1,350

11

EQAS (nếu thực hiện) *

 

0,020

12

Kit tách chiết ARN từ virus

Test

2,350

13

DNA marker

Bộ

1,000

14

Primer 1 (primer đặc hiệu)

ml

0,0001

15

Primer 2 (primer đặc hiệu)

ml

0,0001

16

Primer 3 (primer đặc hiệu)

ml

0,0001

17

Primer 4 (primer đặc hiệu)

ml

0,0001

18

Ống Eppendorf 1,5 ml

Tube

3,000

19

Ống Eppendorf 0,2 ml

Tube

1,000

20

Đầu côn 10 µl có lọc

Cái

1,000

21

Đầu côn 30 µl

Cái

1,200

22

Đầu côn 200 µl có lọc

Cái

2,200

23

Đầu côn 1 ml có lọc

Cái

3,200

24

Ethanol BDH

ml

0,500

25

Water-DEPC Treated

ml

2,000

26

Thạch

Gam

0,075

27

Ladder

ml

0,0025

28

Blue Juice Gel loading dye

ml

0,003

29

Ethidium Bromide

ml

0,100

30

TAE Buffer

ml

0,100

31

Giấy thấm

Cuộn

0,100

32

Giấy xét nghiệm

Tờ

2,000

33

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Tờ

0,001

34

Bút viết kính

Cái

0,020

35

Bút bi

Cái

0,010

36

Cái

0,020

37

Khẩu trang

Cái

0,020

38

Găng tay

Đôi

0,100

39

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0,020

40

Quần áo bảo hộ

Bộ

0,005

41

Dung dịch nước rửa tay

ml

8,000

42

Cồn sát trùng tay nhanh

ml

1,000

43

Dung dịch khử trùng

ml

10,000

44

Khăn lau tay

cái

0,010

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương hoặc tổ chức sinh thiết.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3).

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết RNA tổng số.

Thực hiện RT-PCR.

Điện di kiểm tra sản phẩm.

Giải trình tự gen.

Kiểm tra và so sánh trình tự gen của HCV trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế.

Nhận định kết quả

Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥ 90% mới có thể kết luận được genotype của HCV.

Những sai sót và xử trí

Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết RNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại xét nghiệm.

Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.