Nội dung

Helicobacter pylori nuôi cấy, định danh và kháng thuốc

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện, định danh và xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của  Helicobacter pylori bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển.

Nguyên lý

Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập, phát hiện vi khuẩn H. pylori.

Định danh dựa trên các đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học.

Thử nghiệm tính kháng thuốc của H. pylori bằng kỹ thuật kháng sinh đồ dải giấy khuếch tán theo bậc nồng độ.

Chuẩn bị 

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Kính hiển vi quang học

Tủ ấm thường/t  ấm CO2

 Máy vortex

Máy so độ đục

Pipet 

Đèn cồn, bật lửa

Que cấy, giá đựng que cấy

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Chi phí cho hóa chất và vật tư tiêu hao nuôi cấy, định danh vi khuẩn H. pylori  

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

1

Môi trường nuôi cấy (Pylori agar- PYL/ HPH agar…)

Đĩa

2

Môi trường vận chuyển Portagerm

Lọ

3

Túi Genbag vi hiếu khí

Túi

4

Canh thang Brain Heart Infusion  (37g/1 lít)

ml

5

Thuốc nhuộm tím Gentian

ml

6

Lugol

ml

7

Cồn tẩy 950

ml

8

Thuốc nhuộm đỏ Fucsin

ml

9

Thuốc thử Oxydase

ml

10

Thuốc thử Catalase

ml

11

Urea (3.9g/100ml)

ml

12

Nước muối sinh lý

ml

13

Dầu soi kính

ml

14

Lam kính

cái

15

Que cấy nhựa vô trùng

cái

16

Tube 2 ml vô trùng

cái

17

Que tre vô trùng để nghi n bệnh phẩm

Cái

18

Đầu côn 200µl vô trùng

cái

19

Dung dịch xà phòng rửa tay

ml

20

Dung dịch sát khuẩn tay nhanh

ml

21

Javen + xà phòng + A xít ngâm rửa dụng cụ

ml

22

Bật lửa

cái

23

cái

24

Găng tay

đôi

25

Khẩu trang

cái

26

Giấy lau 

tờ

27

Găng xử lý dụng cụ

đôi

28

Khay đựng bệnh phẩm

cái

29

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

cái

30

Bút dạ

cái

31

Bông

kg

32

Cồn 700

ml

33

Túi đựng rác

cái

34

Áo phòng xét nghiệm

cái

35

Sổ xét nghiệm

tờ

36

Giấy trả kết quả xét nghiệm

tờ

37

Nội kiểm tra chất lượng(QC)* (nếu thực hiện)

 

38

Ngoại kiểm tra (EQAS)* (nếu thực hiện)

 

 

Chi phí cho hóa chất và vật tư tiêu hao thử nghiệm kháng thuốc với vi khuẩn H. pylori

TT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

1.

Môi trường làm kháng sinh đồ cho vi khuẩn H. pylori

 

 

(Mueller Hinton agar + 5% máu ngựa + NAD …..

Đĩa

2.

Thanh Etest

Thanh

3.

Túi Genbag vi hiếu khí

Túi

4.

Canh thang Brain Heart Infusion  (37g/1 lít)

ml

5.

Ống nước muối sinh lý vô trùng

ống

6.

Que tăm bông vô trùng

cái

7.

Đầu côn 200µl vô trùng

cái

8.

Dung dịch sát khuẩn tay nhanh

ml

9.

Javen + xà phòng + A xít ngâm rửa dụng cụ

ml

10.

cái

11.

Găng tay

đôi

12.

Khẩu trang

cái

13.

Giấy lau 

tờ

14.

Găng xử lý dụng cụ

đôi

15.

Bút dạ

cái

16.

Bông

kg

17.

Cồn 700

ml

18.

Túi đựng rác

cái

19.

Áo phòng xét nghiệm

cái

20.

Sổ xét nghiệm

tờ

21.

Giấy trả kết quả xét nghiệm

tờ

22.

Chủng H. pylori ATCC 43504 (không quá 4 chu kỳ chuyển)

Chủng

23.

Nội kiểm tra chất lượng(QC)* (nếu thực hiện)

 

24.

Ngoại kiểm tra (EQAS)* (nếu thực hiện)

 

Ghi chú:

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng > 10 mẫu cho 1 lần tiến nhành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Bệnh phẩm mảnh sinh thiết dạ dày qua ống nội soi

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh  

Lấy bệnh phẩm mảnh sinh thiết dạ dày qua ống nội soi.

Lấy ở vùng hang vị/ thân vị dạ dày, tại các rìa ổ loét hoặc các vị trí có tổn thương nghi ngờ do H. pylori (trợt, niêm mạc sần,…)

Chuyển bệnh phẩm sinh thiết vào môi trường bảo quản, vận chuyển. 

Môi trường vận chuyển có thể là nước muối sinh lý vô trùng nếu vận chuyển ngay về khoa xét nghiệm Vi sinh (trong vòng 1h).  

Nếu thời gian vận chuyển quá 1h giờ sau khi lấy mẫu, các mẫu sinh thiết phải được bảo quản trong môi trường Portagerm pylori, vận chuyển   nhiệt độ (2025 oC) tối đa 48h. Với các mẫu lưu trữ lâu dài, bảo quản ở -80oC trong môi trường chứa 30% glycerol. 

Không nhận những mẫu bệnh phẩm đã ngâm trong dung dịch formalin.

Tiến hành kỹ thuật

Nhuộm gram và nuôi cấy

Nghiền nát các mảnh sinh thiết bằng dụng cụ chuyên dụng hoặc dùng lớp cấy ria trực tiếp mảnh sinh thiết lên mặt đĩa thạch nếu thấy có nhiều nhầy của niêm mạc, phần còn lại dàn tiêu bản để nhuộm Gram.

Đặt đĩa thạch vào trong bình Jar có túi tạo môi trường vi hiếu khí, ủ ấm ở 35- 37oC, quan sát sau 3 đến 7 ngày. 

Định danh

Trên môi trường nuôi cấy, khuẩn lạc nghi ngờ H. pylori là những khuẩn lạc nhỏ, không màu ho c trong; Nhuộm Gram có hình cong, xoắn nhẹ, Gram âm; oxydase (+), catalase (+) và urease (+). Trường hợp vi khuẩn mọc ít cần cấy chuyển sang đĩa thạch mới để tăng sinh.

Thử nghiệm tính kháng thuốc

Từ đĩa nuôi cấy có khuẩn lạc vi khuẩn H. pylori thuần khiết:

Tạo huyền dịch vi khuẩn nồng độ 3 McFarland trong canh thang Mueller Hinton + 5% huyết thanh ngựa hoặc canh thang BHI + 5% huyết thanh ngựa. 

Sau khi ria đều vi khuẩn lên mặt thạch, chờ cho se mặt thạch, dùng panh đầu nhọn đặt Etest lên mặt thạch sao cho mặt có ghi dải nồng độ hướng lên trên và phải đảm bảo toàn bộ bề mặt của thanh Etest được tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch; đặt tối đa 1 thanh Etest trên đĩa 90mm.

Đặt đĩa thạch vào trong bình Jar có túi tạo môi trường vi hiếu khí, ủ ấm ở 35- 37oC, 72 giờ.

Nhận định kết quả

Khuẩn lạc của H. pylori có đỉnh nhọn, mờ và khó nhìn do vậy khi đọc kháng sinh đồ phải nghiêng đĩa thạch và sử dụng ánh sáng xuyên để đọc điểm cắt của hình elip với thanh Etest; Phiên giải kết quả của thanh kháng sinh Etest theo EUCAST.

Những sai sót và xử trí

Kiểm tra chất lượng

Các loại dụng cụ, hóa chất, sinh phẩm, môi trường nuôi cấy phải còn hạn sử dụng và được kiểm tra chất lượng trước khi sử dụng. 

Sử dụng chủng H. pylori ATCC 43504 để kiểm tra chất lượng.

An toàn

Coi tất cả các bệnh phẩm được xem như là nguồn nhiễm, áp dụng các biện pháp an toàn đối với phòng xét nghiệm An toàn sinh học cấp II.

Lưu ý

Nuôi cấy có thể âm tính giả nếu Người bệnh gần đây đã dùng các thuốc kháng sinh hoặc chất ức chế bơm Proton, nên dừng thuốc ức chế bơm Proton 2 tuần và thuốc kháng sinh 4 tuần trước khi nội soi để có kết quả chính xác