Nguyên tắc
Nguyên lý của phương pháp này về cơ bản cũng tương tự nguyên lý của phương pháp huỳnh quang gián tiếp. Ở đây, có thêm hệ thống bổ thể – kháng bổ thể huỳnh quang làm cho việc phát hiện tất cả các loại kháng nguyên chỉ cần có một kháng thể huỳnh quang duy nhất là globulin kháng globulin chuột lang đánh dấu; trong khi ở phương pháp gián tiếp, cần phải có những kháng thể huỳnh quang đặc hiệu cho từng loại (ví dụ: globulin kháng globulin người, globulin kháng globulin thỏ, glubulin kháng globulin ngựa …).
Chuẩn bị
Người thực hiện
Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Máy cắt lạnh
Phiến kính
Lá kính
Kính hiển vi huỳnh quang
Giá đựng tiêu bản nằm ngang
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút tự động
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Tủ ấm 37o.
Cồn – ete tỷ lệ 1/1.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính, parafin nóng chảy.
Nguồn cấp nước chảy.
Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
Dung dịch đệm photphat pH 7,2.
ch glycerin đệm photphat 1%.
Kháng huyết thanh, đặc hiệu- bổ thể.
Kháng kháng thể huỳnh quang
Các bước tiến hành
Bệnh phẩm tươi (chưa cố định) được tiến hành làm phiến đồ hoặc cắt lạnh theo quy trình cắt lạnh bệnh phẩm.
Cắt các lát mỏng, có độ dầy 5µm.
Nhỏ lên các mảnh cắt đã cố định trên các phiến kính: kháng huyết thanh đặc hiệu.
Bổ thể (đã pha 1:5 đến 1:10 tuỳ theo chuẩn độ) để 30 phút trong hộp ẩm ở 370C.
Đổ huyết thanh thừa đi, tráng kỹ nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
Ngâm 30 phút trong dung dịch đệm trên, thay đổi hai lần.
Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một vài giọt bổ thể đã đánh dấu, để 30 phút trong hộp ẩm ở 370C.
Đổ kháng thể – bổ thể thừa đi rồi tráng kỹ và nhẹ nhàng bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2.
Ngâm bằng dung dịch đệm photphat pH 7,2 trong 30 phút x hai lần.
Để ráo nước ở nhiệt độ thường.
Khi các mảnh cắt còn hơi ẩm, nhỏ lên một giọt glycerin đệm photphat 1%, đậy bằng lá kính. Gắn xung quanh lá kính bằng parafin hoặc bằng bất cứ loại nhựa nào, đảm bảo không làm khô mảnh cắt.
Kết quả
Kháng thể cần phát hiện có màu xanh lá cây.
