Nguyên tắc
Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH) sử dụng mồi dò DNA gắn huỳnh quang để xác định khuyếch đại gen Her-2/neu.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Bác sĩ giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện
Máy ThermoBrite
Kính hiển vi huỳnh quang
Phiến kính, lá kính
Máy cắt lát mỏng
Lưỡi dao cắt lát mỏng
Tủ ấm 370 và 560
Tủ lạnh
Ống hút.
Hóa chất
Bộ kít PathVysion
Cồn (700, 800, 850, 900, 1000).
Xylen
Dung dịch rửa.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị mẫu
Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan.
Các mảnh cắt được ủ qua đêm ở nhiệt độ 560C.
Đánh dấu vùng tế bào u xâm lấn bằng bút viết kính.
Khử parafin của mảnh cắt
Nhúng các mảnh cắt vào xylen 3 lần, mỗi lần 5 phút.
Khử nước bằng cồn 90o, 2 lần, mỗi lần 5 phút.
Làm khô các mảnh cắt ở 450C: 2-5 phút.
Rửa nước cất 1 lần: 3 phút.
Rửa các mảnh cắt bằng dung dịch đệm 1 lần: 3 phút.
Nhúng trong dung dịch đệm nhiệt độ 800C: 30 phút.
Rửa nước cất 1 lần: 1 phút.
Rửa bằng dung dịch đệm ở nhiệt độ phòng 2 lần, mỗi lần 5 phút.
Xử lý protease
Các mảnh cắt được lau khô các vùng nước đọng.
Ngâm trong dung dịch protease: 10-60 phút ở nhiệt độ 370 C.
Rửa bằng dung dịch đệm 2 lần, mỗi lần 5 phút.
Làm khô ở 450C: 2-5 phút.
Khử nước
|
Cồn 700: |
|
1 phút, nhiệt độ phòng |
|
Cồn 850: |
|
1 phút, nhiệt độ phòng |
|
Cồn 1000: |
|
1 phút, nhiệt độ phòng |
Làm khô ở 450C: 2-5 phút.
Tách dna và lai đồng thời
Dùng máy ThermoBite, thực hiện công đoạn trong buồng tối.
Làm ấm lọ chứa đoạn đầu dò bằng máy lắc.
Lấy 5 µl đoạn dò, nhỏ lên vùng ung thư xâm nhập đã được đánh dấu.
Gắn lá kính kích thước 22 mm x 22 mm, phủ mép lá kính bằng nhựa cao su.
Kích hoạt chương trình của máy.
Tách DNA ở 750C: 5 phút.
Lai đoạn dò DNA đích ở 370C: 18 giờ, đảm bảo buồng lai tối.
Tạo môi trường ấm, đậy nắp.
Rửa sau khi lai (thực hiện trong buồng tối).
Làm nóng dung dịch rửa sau lai ở 720C.
Chuẩn bị một lọ dung dịch rửa sau lai ở nhiệt độ phòng.
Nhúng các mảnh cắt vào lọ dung dịch sau lai ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ để lá kính rời ra.
Lau những giọt nước đọng trên các phiến kính.
Nhúng vào dung dịch sau lai ở nhiệt độ 720C: 2 phút.
Lau khô trong buồng tối.
Nhuộm màu tương phản nhân
Nhỏ 5 µl DAPI vào vùng đã chọn.
Dán lá kính.
Khảo sát tiêu bản
Bảo quản tiêu bản vào hộp giấy bạc, giữ ở – 200C, ít nhất 30 phút trước khi quan sát.
Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang có nhiều kính lọc các bước huỳnh quang.
Kết quả
Đánh giá kết quả dựa vào tỷ lệ tín hiệu màu vàng (gen Her-2/neu) và tín hiệu màu xanh (nhiễm sắc thể 17).
Đếm tín hiệu trên 20 nhân tế bào u xâm nhập, các nhân tế bào được đếm phải tách rời, không chồng lên nhau.
Tỷ lệ Her-2/NST17
Tỷ lệ Her-2/NST17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
Tỷ lệ 2,5
Tỷ lệ Her-2/NST17 > 5: khuyếch đại cao
1,8 ≤ Tỷ lệ Her-2/NST17
Số lượng tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.
Những sai sót và hướng xử trí
|
KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Khử parafin không hết |
Tăng thời gian khử parafin hoặc thay thế xylene mới |
|
Sử dụng thiết bị lọc không đúng |
Sử dụng thiết bị lọc theo đúng bước sóng của probe |
|
Kính hiển vi lỗi |
Gọi hỗ trợ kỹ thuật |
|
Điều kiện lai không chính xác |
Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai hoặc buồng lai |
|
Nhiệt độ rửa sau khi lai không chính xác |
Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa hoặc tăng thời gian lai |
|
Có bóng khí khi gắn lá kính |
Loại bỏ bóng khí trước khi đưa vào máy lai |
|
Không đủ dung dịch lai hoặc probe |
Tăng thêm lượng probe |
|
Digest không đủ |
Kiểm tra lại nhiệt độ digest hoặc tăng thêm thời gian digest |
|
Thời gian cố định quá dài |
Kiểm tra lại quy trình cố định bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định ngay sau mổ trong 6 – 48 giờ, hoặc có thể giảm bớt thời gian bộc lộ |
|
TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên bệnh phẩm |
Kiểm tra lại quá trình nhuộm DAPI Tăng thêm thời gian cố định |
|
Probe phân bố không đều trên bệnh phẩm do có bọt khí |
-Thực hiện lại quá trình lai và đảm bảo không có bọt khí |
|
Kích thước bệnh phẩm quá lớn |
-Tăng thể tích dung dịch lai |
|
NHUỘM NỀN CAO (HIGH GROUND) |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Do quá trình rửa sau khi lai |
Kiểm tra lại pH của dung dich rửa (7.2-7.5) Kiểm tra lại nhiêt độ buồng rửa Lắc trong quá trình rửa Tăng thời gian rửa lên 5 phút |
|
MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM |
|
|
NGUYÊN NHÂN |
CÁCH KHẮC PHỤC |
|
Sấy tiêu bản không đúng |
-Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy (56oC) |
|
Bộc lộ quá mức |
Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ Giảm thời gian bộc lộ Giảm thời gian digest |
|
Biến tính quá mức |
Kiểm tra lại nhiệt độ biến tính Giảm thời gian biến tính |
|
Bệnh phẩm bị bong ra khi loại bỏ lá kính sau khi lai |
-Loại lá kính bằng cách ngâm tiêu bản sau lai vào dung dịch rửa và lắc đều |
