Kỹ thuật nested rt – pcr phát hiện gen lai bcr/abl

KỸ THUẬT NESTED RT – PCR PHÁT HIỆN GEN LAI BCR/ABL

NESTED RT – PCR DETECTION OF BCR/ABL FUSION GENE

 

NGUYÊN LÝ

Kỹ thuật “ nested” RT – PCR dựa trên nguyên lý chung của kỹ thuật PCR: sử dụng hoạt tính tổng hợp ADN của enzym Taq – polymerase; cùng với các vật liệu cơ bản gồm các bazơ nitơ tự do (dNTPs), hai đoạn mồi: mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) để nhân bản đoạn gen quan tâm. Do đối tượng cần khuếch đại của kỹ thuật RT – PCR là ARN thông tin vì vậy phản ứng “nested” RT – PCR sẽ gồm có 3 bước cơ bản như sau:

Bước 1 – RT (reverse transcription – phiên mã ngược): là bước chuyển đổi ARN sợi khuôn thành sợi ADN bổ trợ (ADNc), được thực hiện bởi enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase).

Bước 2 – PCR vòng 1: sử dụng sản phẩm của bước 1 làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR với sự tham gia của cặp mồi vòng ngoài (external primer) để nhân bản vùng gen có chứa trình tự gen đích BCR – ABL.

Bước 3 – PCR vòng 2: sản phẩm PCR vòng 1 được sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR lần 2 với sự tham gia của cặp mồi vòng trong (internal primer) để nhân bản chính xác đoạn gen đích.

CHỈ ĐỊNH

Sử dụng cho tất cả người bệnh có chẩn đoán CML/ALL/CLL.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.

Phương tiện – Hóa chất

Phương tiện

Máy PCR;

Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;

Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);

Buồng vô trùng (biology cabinet);

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

Máy vortex;

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;

Đầu côn có màng lọc;

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Tủ lạnh 4 – 8⁰C, tủ âm sâu – 20⁰C;

Găng tay.

Hóa chất

Dung dịch Ficoll hoặc dung dịch ly giải tế bào hồng cầu gồm các muối MgCl2, Tris – HCl, NaCl.

Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Hóa chất chạy nested RT – PCR: kit tổng hợp ADNc, kit RT – PCR onestep, PCR supermix. Nếu không sử dụng kit thương mại thì sử dụng các thành phần riêng lẻ như: Đệm, MgCl₂, dNTPs, enzym phiên mã ngược, enzym kéo dài chuỗi, mồi oligodT hoặc mồi ngẫu nhiên (random primer), các cặp mồi đặc hiệu, nước khử ion vô trùng.

Hóa chất điện di: thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN, thuốc nhuộm ethidium bromide.

Bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA

Tiến hành kỹ thuật Bước 1: Tách chiết ARN:

Xem bài “Tách chiết ARN từ máu ngoại vi/tủy xương

Bước 2: Thực hiện phản ứng RT – PCR vòng 1(thao tác ở 4^oC)

Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.

Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống eppendorf 0,2 ml: master mix (đã bao gồm đệm, dNTPs, MgCl₂), cặp mồi vòng ngoài, hỗn hợp enzym phiên mã ngược và enzym tổng hợp chuỗi (Taq – platinum), nước khử ion vô trùng, ARN khuôn, được trình bày như bảng dưới đây:

STT	Sinh phẩm	Thành phần (µl)/1 pứ
1	Đệm	12,5
2	ARN	100 ng
3	Mồi xuôi (10pM/ µl)	1,0
4	Mồi ngược (10pM/ µl)	1,0
5	Taq – platinum	0,5 U
6	H2O	Đủ thể tích 25 µl
	Tổng thể tích	25,0

Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn

Đặt vào máy PCR

Chọn chương trình

Bấm start để máy chạy

bước 3: thực hiện phản ứng pcr vòng 2 (thao tác ở 4°c)

Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.

Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống eppendorf 0,2 ml: Master mix (đã bao gồm đệm, dNTPs, MgCl₂), cặp mồi vòng trong đặc hiệu cho tổ hợp gen BCR – ABL, enzym tổng hợp chuỗi, nước khử ion vô trùng, sản phẩm RT – PCR vòng 1, được trình bày như bảng dưới đây:

STT	Sinh phẩm	Thành phần (µl)/1 pứ
1	Đệm	12,5
2	Sản phẩm PCR vòng 1	1
3	Mồi xuôi (10pM/ µl)	1,0
4	Mồi ngược (10pM/ µl)	1,0
5	Enzym	0,5 U
5	H2O	Đủ thể tích 25 µl
	Tổng thể tích	25,0

Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn;

Đặt vào máy PCR;

Chọn chương trình;

Bấm start để máy chạy.

Bước 4. Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:

Cân agarose cho vào bình đun gel (nồng độ 1% = 1gram/100ml);

Thêm đệm TBE 1X hoặc TAE 1X vào bình, lắc đều;

Đun sôi đến agarose tan hoàn toàn;

Để ấm đến 60⁰C rồi đổ vào khay gel;

Để nhiệt độ phòng 30 phút để gel ổn định.

Điện di:

Đặt gel vào khay điện di, đổ đầy đệm chạy và rút lược từ từ ra khỏi gel để tránh vỡ giếng;

Chuẩn bị hỗn hợp: 5µl sản phẩm PCR + 1 µl loading dye 10X + 4 µl dH₂0.

Trộn đều và bơm vào các giếng theo thứ tự đã đánh dấu;

Sử dụng 3 µl ADN ladder để làm thang tính toán kích thước sản phẩm;

Điện di trong khoảng 30 – 40 phút, 110V;

Nhuộm bản gel với dung dịch Ethidium bromide trong 5 phút và soi, chụp ảnh trên đèn soi gel U

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết .

Trong trường hợp sản phẩm PCR có băng không rõ ràng, nhiều băng không đặc hiệu hoặc đối chứng không chính xác thì phải lặp lại xét nghiệm.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

SAI SÓT	XỬ TRÍ
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.	Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu.
Thao tác pipet không chính xác.	Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.	Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất
	Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

 

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124 – 125.

A.Rolfs et at (1992). PCR: Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag, Berlin.

van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. StADNardized RT – PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Leukemia 1999;13,1901 – 28.