Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định mức độ kháng thuốc của Mycobacterium tuberculosis với các thuốc kháng lao hàng 2 bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường đặc.
Nguyên lý
Huyền dịch vi khuẩn được pha loãng bậc hai và cấy vào môi trường không thuốc và môi trường có thuốc lao theo nồng độ xác định. Tính tỉ lệ phần trăm giữa số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường có thuốc và môi trường không có thuốc. Xác định sự kháng của vi khuẩn lao với từng loại thuốc bằng cách so tỉ lệ trên với ngưỡng kháng: Nếu trên hoặc bằng ngưỡng là vi khuẩn kháng thuốc; dưới ngưỡng là vi khuẩn nhạy cảm.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy lắc.
Tủ lạnh.
Cân.
Đồng hồ phút.
Nồi hấp.
Tủ ấm hoặc buồng ấm (35 – 38°C).
Pipet tự động loại 20 – 100 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
I |
Hoá chất |
|
|
|
1 |
KH2PO4 |
gam |
0,100 |
|
2 |
MgSO4 |
gam |
0,010 |
|
3 |
MgCitrat |
gam |
0,025 |
|
4 |
Asparagin |
gam |
0,150 |
|
5 |
Glyxerol |
ml |
0,500 |
|
6 |
Malachite |
gam |
0,020 |
|
7 |
Trứng gà |
quả |
1,000 |
|
8 |
Cồn 70° |
ml |
70,000 |
|
9 |
Nước cất |
ml |
65,000 |
|
10 |
OF |
g |
0,0005 |
|
11 |
AM |
g |
0,0005 |
|
12 |
KM |
g |
0,0006 |
|
13 |
CAP |
g |
0,0006 |
|
14 |
PNB |
g |
0,0025 |
|
15 |
Propylenglycol |
ml |
0,100 |
|
16 |
Presept |
viên |
0,050 |
|
17 |
Microshiel |
ml |
1,000 |
|
18 |
McFarland số 1 |
ống |
0,001 |
|
19 |
Chủng chuẩn quốc tế H37 Rv |
ống |
0,001 |
|
II |
Vật tư tiêu hao |
|
|
|
20 |
Tuýp nhựa vô trùng loại 15 ml |
cỏi |
2,500 |
|
21 |
Đầu côn nhựa loại 0,1ml |
cái |
2,000 |
|
22 |
Tuýp thủy tinh trung tính nút xoáy |
cái |
0,300 |
|
23 |
Bông thấm nước |
gam |
0,500 |
|
24 |
Bi thủy tinh 3 mm |
viên |
5,000 |
|
25 |
Bô can |
cái |
0,010 |
|
26 |
Găng tay |
đôi |
0,200 |
|
27 |
Túi nilon loại 2 lớp chịu nhiệt hấp |
cái |
0,050 |
|
28 |
Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm |
cái |
0,020 |
|
29 |
Thùng rác có nắp |
cái |
0,001 |
|
30 |
Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm |
cái |
0,001 |
|
31 |
Gạc lọc |
mét |
0,030 |
|
32 |
Bông thấm nước |
gam |
0,500 |
|
33 |
Pipette nhựa 10ml |
cái |
0,200 |
|
34 |
Đầu côn nhựa loại 1ml |
cái |
0,010 |
|
35 |
Găng tay |
đôi |
0,200 |
|
36 |
Tuýp thủy tinh trung tính nút xoáy |
cái |
2,000 |
|
37 |
Bình cầu 2000ml |
cái |
0,001 |
|
38 |
ống đong 500ml |
cái |
0,001 |
|
39 |
ống đong 50ml |
cái |
0,001 |
|
40 |
Phễu thuỷ tinh 500ml |
cái |
0,001 |
|
41 |
Cốc mỏ 500ml |
cái |
0,001 |
|
42 |
Cốc có mỏ 200ml |
cái |
0,001 |
|
43 |
Chai thủy tinh trung tớnh 1000ml |
cái |
0,003 |
|
44 |
Giấy nháp |
tờ |
0,010 |
|
45 |
Giá đựng tuýp |
cái |
0,001 |
|
46 |
Khay đựng môi trường |
cái |
0,001 |
|
47 |
Mũ |
cái |
0,020 |
|
48 |
Khẩu trang N95 |
cái |
0,020 |
|
49 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
50 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,001 |
|
51 |
Dung dịch tẩy rửa dụng cụ |
ml |
10,000 |
|
52 |
Bút bi |
cái |
0,010 |
|
53 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
54 |
Khăn lau tay |
cái |
0,005 |
|
55 |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
56 |
Nhãn mã vạch |
cái |
10,000 |
|
57 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,1 |
|
58 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Chủng đã định danh vi khuẩn lao.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Chuẩn bị môi trường dụng cụ.
Tiến hành kỹ thuật.
Xử lý vật liệu lây nhiễm.
Nhận định kết quả
Kiểm tra ngoại nhiễm: Sau 24 – 48 giờ.
Kiểm tra sau 72 giờ: Mặt môi trường khô, xoáy nắp tuýp tránh bay hơi làm khô môi trường.
Theo dõi trong vòng 6 tuần.
Đọc kết quả KSĐ 2 lần sau 4 tuần và sau 6 tuần.
Đánh giá kết quả như kỹ thuật cấy.
|
Đọc kết quả cấy |
Nhận định kết quả cấy |
|
Không thấy khuẩn lạc |
Âm tính |
|
1 – 19 khuẩn lạc |
Dương tính: số khuẩn lạc |
|
20 – 100 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc mọc 1/3 bề mặt môi trường) |
Dương tính: 1 + |
|
100 – 200 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc mọc ½ bề mặt môi trường) |
Dương tính: 2 + |
|
200 – 500 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc mọc 2/3 bề mặt môi trường) |
Dương tính: 3 + |
|
> 500 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc phủ kín toàn bộ bề mặt môi trường) |
Dương tính: 4 + |
|
Nhiễm vi khuẩn hoặc nấm |
Ngoại nhiễm |
So sánh kết quả vi khuẩn mọc giữa ống chứng và ống có thuốc, so với ngưỡng kháng =1% là kháng thuốc.
Những sai sót và xử trí
Khi làm KSĐ, chọn các ống môi trường đều nhau, sản suất cùng lô cho 1 chủng.
Xếp dụng cụ để trống vị trí đầu khi thao tác có ô trống tránh nhầm lẫn.
Gặt chủng hạn chế lẫn môi trường.
Bảo quản chủng ở nhiệt độ 2 – 8°C qua đêm nghiền tan dễ dàng hơn.
Lau pipette bằng bông cồn 70° sau khi cấy mỗi chủng.
Kiểm tra lượng huyền dịch đủ 0,1 ml mỗi lần hút.
Thường xuyên theo dõi quá trình ủ ấm, phát hiện loại bỏ ngoại nhiễm, làm lại kịp thời.
Vi khuẩn mọc trên ống LJ – PNB, kiểm tra lại kết quả định danh.
Làm lại kháng sinh đồ sớm nhất có thể trong các trường hợp sau:
Vi khuẩn không mọc trên tuýp chứng.
Số lượng khuẩn lạc trên tuýp chứng ở nồng độ 10 – 2
Tỷ lệ kháng xấp xỉ ngưỡng kháng.
Ngoại nhiễm.
