Nguyên tắc
Kỹ thuật diamin sắt cao được coi là kỹ thuật chuẩn để phát hiện các chất nhày có nhóm sunfat. Nguyên lý của phương pháp: một hỗn hợp các muối diamin được oxy hoá bằng clorua sắt hình thành một chất màu đen, liên kết với các nhóm sunfat este. Bằng cách nhuộm tương phản với xanh alcian (mà chỉ nhuộm các chất nhày carboxyl hoá), đã phân biệt được rõ về màu sắc giữa 2 nhóm chính của chất nhày acid. Một điều đáng chú ý, đó là các chất nhày sunfat của các tuyến phế quản dường như không phản ứng với hỗn hợp diamin clorua sắt.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Các hóa chất cần riêng cho phần nhuộm như sau:
Sodium photphat monobasic
Sodium photphat dibasic (khan: anhydrous)
Xanh alcian
Acid acetic
Đỏ trung tính.
N,N – dimethyl – meta – phenylenediamin – dihydrochlorit.
N,N – dimethyl – para – phenylenediamine- dihydrochlorit.
Clorua sắt
Cồn etylic 950, 1000
Nước cất 2 lần.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Pha phẩm nhuộm
N,N – dimethyl – meta – phenylenediamin – dihydrochlorid: 120mg
N,N – dimethyl – para – phenylenediamin – dihydrochlorid: 20mg
Nước cất 2 lần: 50mg
Clorua sắt: 0,084g trong 1,4ml nước cất 2 lần.
Hoà tan riêng rẽ 2 muối diamin trong nước cất, sau đó thêm dung dịch clorua sắt rồi trộn lẫn. Bảo quản trong lọ màu, nút mài.
Các bước nhuộm
Để khô mảnh cắt ở tủ 370C, 12 giờ trước khi nhuộm.
Các mảnh cắt làm chứng và các mảnh cắt cần nhuộm được tẩy parafin, qua cồn, rửa nước và rửa nước cất.
Nhúng các mảnh cắt trong dung dịch diamin 18-24 giờ.
Rửa kỹ trong nước chảy.
Nhuộm tương phản (nếu cần thiết) bằng xanh alcian 1% trong acid acetic 3% trong 5 phút.
Nhuộm nhân bằng đỏ trung tính 0,5% trong 2-3 phút.
Rửa qua nước.
Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối.
Làm trong bằng xylen và gắn lá kính bằng bôm Canada.
Kết quả
Sulfat mucin : đen-nâu
Carboxylate mucin : xanh
Nhân : đỏ.
