Nguyên tắc
Đây là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp. Nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02.
Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm: phẩm nhuộm nhân và bào tương có thể mua dạng thương mại, dùng luôn. Nếu không có sản phẩm dùng ngay, có thể pha phẩm nhuộm theo cách thức dưới đây:
Hematoxylin Harris:
Hematoxylin (tinh thể) 1g
Cồn (etanol) tuyệt đối 10ml
Alun (ammonium hay potassium) 20g
Nước cất 200ml
Oxyt thuỷ ngân (đỏ) 0,5g
Tiến hành pha:
Hoà tan hematoxylin trong cồn.
Hoà tan alun trong nước cất nóng. Đưa ra khỏi lửa và trộn hai dung dịch với nhau.
Đun sôi hỗn hợp, kéo bình đun ra khỏi lửa và thêm vào dần oxyt thuỷ ngân.
Đun nóng lại, khi hỗn hợp có màu tím sẫm, tắt lửa và nhúng ngay bình đun vào nước lạnh.
Khi bình đun lạnh hẳn, thêm 2ml acid acetic lạnh để làm tăng tính nhuộm nhân.
Eosine Y: ở Việt Nam thường pha dung dịch 0,5% trong cồn 95o.
L.G. Koss pha theo công thức :
Eosine Y (CI. No 45830) 16g hoặc 1g
Dichromat kali 8g hoặc 0,5g
Acid picric (nước bão hoà) 160ml hoặc 10ml
Cồn etanol 95o 160ml hoặc 10ml
Nước cất 1280 ml hoặc 80ml
Hoà tan eosin và dichromat kali vào nước cất, đun nóng nếu cần, sau đó thêm dung dịch acid picric, cồn.
Các bước tiến hành
Cố định: Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm.
Vùi parafin.
Đúc khối parafin.
Cắt và dán mảnh cắt.
Nhuộm.
Thực hiện các bước sau:
Tẩy parafin trong 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 5 phút.
Qua 4 bể cồn: 100º – 95º – 80º – 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.
Rửa nước cất: nhúng 15 lần.
Nhuộm nhân bằng Hematoxylin Harris: 3-5 phút hoặc lâu hơn.
Rửa nước chảy: 5-10 phút.
Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
Rửa nước chảy: 1 phút.
Nhuộm Eosin1%: 1 -2 phút.
Rửa nước chảy: 1 phút.
Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º – 100º, mỗi bể 15 lần nhúng.
Qua 3 bể toluen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.
Gắn lá kính
Kết quả
Nhân tế bào: xanh đến xanh đen
Bào tương tế bào: hồng đến đỏ
Hồng cầu: hồng đậm
Sợi tạo keo: hồng nhạt.
Những sai sót và hướng xử trí
Bào tương và nhân đều bắt màu nhạt: thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.
Nhân nhạt màu: tăng thời gian nhuộm nhân.
Nhân đậm màu quá mức: tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
