Nguyên tắc
Thông thường, virus có kích thước rất nhỏ và chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Virus chỉ được coi là vật ký sinh khi chúng sinh sản (được nhân lên) trong tế bào vật chủ. Các tiểu phần virus nằm bên trong tế bào vật chủ được gọi là “thể vùi virus” và có thể thấy bằng kính hiển vi quang học. HBsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B) thường xuất hiện dưới dạng thể vùi trong bào tương tế bào gan. Bào tương của tế bào Küpffer cũng có thể có kháng nguyên này.
Phẩm nhuộm orcein và andehit – fuscin có khả năng nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần cistin của HBsAg và tạo ra hình ảnh “thủy tinh mờ” của tế bào gan bị nhiễm virus.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính. – Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): permanganat kali, acid sunfuric đậm đặc, acid oxalic, Orcein, acid periodic, HCl.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 – 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Dung dịch permanganat kali được acid hóa:
Permanganat kali: 0,3 g
Nước cất: 100ml
Acid sunfuric đậm đặc: 0,3ml 6.1.2. Dung dịch acid oxalic: 1,5%
Pha orcein:
Hòa tan 1,0g orcein tổng hợp bằng cách đổ dần dần từng ít cồn 70 độ trong khi đang đun nóng nhẹ, cách thủy, vào khoảng 56ºC (tổng lượng cồn cần dùng để hòa tan là 100ml) cho đến khi hòa tan hết.
Sau đó, thêm 1 ml HCl đậm đặc.
Dung dịch acid periodic 5%
|
Acid periodic: Nước cất: Dung dịch biệt hóa cồn – acid |
0,5g 100ml |
|
Cồn 70 độ: HCl: |
100ml 1ml |
Tiến hành kỹ thuật
Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
Rửa nước
Oxy hóa trong permanganat kali (5 – 10 phút)
Rửa nước
Tẩy trắng trong acid oxalic (nhìn cho tới trắng)
Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất
Acid periodic 5% trong 5 phút
Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất
Nhuộm orcein trong lò vi sóng ở công suất thấp trong 30 – 45 giây, rồi tiếp tục để như vậy trong 30 phút. Kiểm tra dưới kính hiển vi, có thể nhuộm lại nếu chưa đủ màu đen.
Rửa trong cồn 70o.
Biệt hóa trong cồn-acid 1% cho tới khi không còn phẩm màu chảy ra từ mảnh cắt.
Rửa bằng cồn 70o.
Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối
Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
Gắn lá kính như thường lệ
Kết quả
Kháng nguyên HBsAg, sợi chun: đỏ tía
Các protein liên kết với đồng : đỏ tía sẫm
Nền: đỏ tía ánh nâu nhạt
Những sai sót và hướng xử trí
Các kháng nguyên này thường tập trung thành hạt to, nhỏ khác nhau trong bào tương tế bào gan. Trường hợp hạt nhỏ, thường ở dạng lan tỏa, trong khi, dạng hạt lớn hơn, có hình tròn hoặc bầu dục lại tụ thành nhóm.
