Nguyên tắc
Phương pháp nhuộm cho thấy rõ cấu trúc xương. Phương pháp này không phải là nhuộm thực sự nhưng giống phương pháp Gomori. Một kết tủa chất màu thấm vào các hốc và các ống nhỏ, nó cũng thấm mạnh hơn vào các khoảng trống khác của tuỷ xương, trong các mô. Các mô có thể bị loại đi một phần nào mà không gây tác hại cho phẩm nhuộm bằng cách để các mảnh cắt ở bước 5 trong nửa giờ. Lúc đó các ống nhỏ sẽ bắt màu từ đỏ nhạt tới đỏ, chất xương xanh hoặc không có màu. Thông thường, nên nhuộm các mảnh cắt trước bằng hematoxylin-alun để làm rõ các nhân tế bào.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật
Cồn (500, 700, 800, 950, 1000).
Xylen hoặc toluen.
Nước cất 2 lần – Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtom).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Tủ ấm 370 và 560
Tủ lạnh – Điều hòa nhiệt độ
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bể nhuộm bằng thủy tinh
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen
Khuôn nhựa
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang)
Cốc đong 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích
Giấy lọc, phiến kính, lá kính sạch
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Hoặc dùng hoá chất có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn phía dưới, bao gồm:
Dung dịch cố định bệnh phẩm: dung dịch Muller hoặc dung dịch Orth hoặc formol đệm trung tính 10%.
Celloidin
Cồn tuyệt đối- ete thể tích 1/1.
Tinh dầu terpincol hoặc tinh dầu origanum.
Dung dịch khử calci.
Acid picric bão hoà trong nước (1,22%).
Dung dịch Apathy, dung dịch Bolles Lee.
Dung dịch thionin – carbol của Nicolle.
Dung dịch thionin.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được cố định trong dung dịch Muller hoặc dung dịch Orth hoặc formol đệm trung tính 10%, không dùng dung dịch HgCl2.
Khử calci bằng một trong những phương pháp chậm hơn: dịch Ebner (NaCl bão hoà trong nước) 100ml; HCl đậm đặc, 4ml và mỗi ngày cho thêm 2ml HCl trong khi cố định (hoặc dung dịch Muller, HNO3 3%).
Bệnh phẩm đã cố định được khử nước thật cẩn thận.
Chuyển ngay vào dung dịch cồn tuyệt đối- ete thể tích 1/1 tới khi ngấm hoàn toàn (khoảng 24 giờ).
Chuẩn bị dung dịch Apathy: Clorofoc 40g + dầu origan 20g + tinh dầu bách hương 40 g + Cồn tuyệt đối 10g + Phenol 10g.
Chuẩn bị dung dịch Bolles Lee: Clorofoc 1 thể tích + tinh dầu bách hương 2 thể tích.
Vùi celloidin
Tẩm bệnh phẩm trong các dung dịch celloidin 2%, 4% rồi 8% (pha trong dung dịch cồn tuyệt đối- ete thể tích 1/1). Nếu dùng dung dịch bán sẵn cần xem kỹ nồng độ trên nhãn sản phẩm. Thời gian tẩm: 2 ngày với dung dịch 2%; 1 tuần với dung dịch 4% và 4 tuần với dung dịch 8%. Trong suốt thời gian tẩm, bệnh phẩm bảo quản trong lọ thật kín, tránh ẩm ướt.
Khi đã ngấm đủ celloidin, cho bay hơi một phần tới lúc nồng độ cuối cùng đạt 16-20% là được (dùng bình hút ẩm chứa acid sunfuric hay anhydric photphoric, lượng dung dịch vùi ban đầu giảm 50% là được).
Đúc
Đổ dung dịch celloidin 8% cùng với bệnh phẩm vào một khuôn bằng giấy.
Làm cứng khuôn bằng cách cho tiếp xúc với hơi cồn 70° hay hơi clorofoc (thường bằng cách sau: cho bệnh phẩm ở khuôn giấy vào một bình trong đó có một lọ nhỏ hở miệng chứa cồn 70° hay clorofoc).
Khi khối bệnh phẩm đã cứng, cắt gọt bằng dao lưỡi dài.
Chuyển khối bệnh phẩm vào trong cồn 70° hay clorofoc sau 24 giờ sẽ đủ độ cứng cần thiết.
Làm trong bằng cách nhúng khối bệnh phẩm vào hỗn hợp Apathy hay Bolles Lee. Thay hỗn hợp 2 lần tới khi trong hẳn. Các khối bệnh phẩm này được bảo quản trong cồn hay tinh dầu terebentin.
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Dung dịch thionin – carbol của Nicolle
|
Thionin, dung dịch bão hoà (0,25%) trong cồn 500: |
|
10ml |
|
Phenol nước 1%: Dung dịch thionin |
|
100ml. |
|
Thionin dung dịch bão hoà (0,25%) trong cồn 500: |
|
2ml |
|
Nước cất: |
|
10ml. |
Các bước nhuộm
Ngâm các mảnh cắt ít nhất 10 phút trong nước cất để loại hết cồn.
Nhuộm 5 – 10 phút hoặc lâu hơn trong dung dịch A hoặc dung dịch B.
Rửa trong nước cất.
Ngâm 30 giây – 1 phút trong acid picric bão hoà trong nước (1,22%).
Rửa nước cất.
Ngâm trong cồn 700 khoảng 5-10 phút cho đến khi không còn vẩn đục màu.
Loại nước trong cồn 950.
Làm trong bằng tinh dầu terpincol hoặc tinh dầu origanum.
Gắn bôm.
Kết quả
|
Chất xương: |
vàng tới nâu vàng nhạt |
|
Các hốc và ống nhỏ của xương: |
nâu thẫm tới đen |
|
Các tế bào: |
đỏ |
|
Tế bào mỡ (sau dịch Muller): |
tím đỏ nhạt |
|
Mô xương: |
vàng thẫm hơn mô dạng xương |
