Nguyên tắc
Đây là kỹ thuật nhuộm xác định các loại chất nhầy khác nhau (loại acid, trung tính hoặc kiềm, thường được áp dụng cho các tổn thương đường tiêu hóa). Nguyên lý dựa vào tính chất thuốc nhuộm cation và hình thành các liên kết với các anion nhất định trong mô mang nhóm carboxyl hoặc nhóm sunfat, tạo nên các liên kết tĩnh điện cationanion. Gốc photphat của acid nhân không sẵn sàng liên kết với thuốc nhuộm xanh alcian. Có thể nhuộm xanh alcian ở các độ pH khác nhau để phân biệt các chất nhầy acid.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung cho kỹ thuật
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Thuốc nhuộm xanh alcian được pha theo hướng dẫn ở mục 6.1. dưới đây.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm lấy ra khỏi cơ thể được đưa ngay vào dung dịch cố định (formol đệm trung tính 10%) với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20-30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-24 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau khi cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc bệnh phẩm
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị thuốc nhuộm
Pha dung dịch xanh alcian 1% trong acid acetic 3% (pH 2,5)
Xanh alcian 1g
Acid acetic 3% 100ml
Hòa tan xanh alcian trong acid acetic. Lọc trước khi sử dụng.
Pha dung dịch xanh alcian 1% trong acid hydrochloric 0,1M (pH 1,0)
Xanh alcian 1g
Acid hydrochloric 0,1M 100ml
Hòa tan xanh alcian trong acid hydrochloric. Lọc trước khi sử dụng.
Pha dung dịch natri carbonat 0,3%
Natri cacbonat 0,3 g
Nước cất 100ml
Hòa tan natri carbonat trong nước cất, lắc đều cho đến khi tan hết.
Tiến hành nhuộm
Tẩy nến trong toluen 3 lần, mỗi lần 2 phút
Chuyển vào bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
Rửa nước chảy 5 phút
Đặt trong dung dịch acid acetic 3% trong 2 phút
Nhuộm trong dung dịch xanh alcian 1%: 30 phút
Rửa nước chảy 5 phút
Để trong dung dịch natri carbonat 0,3% trong 30 phút
Rửa nước chảy 5 phút
Nhuộm nhân trong Hematoxylin Mayer: 7 phút
Rửa nước chảy 5 phút
Loại nước bằng cồn 80°, 95°, 100°.
Làm trong qua 3 bể toluen.
Gắn lá kính bằng bôm Canada.
Đánh giá kết quả
Chất nhầy acid: màu xanh ngọc
Nhân tế bào: màu xanh nhạt
Những sai sót và hướng xử trí
Những sai sót và xử trí khi nhuộm nói chung
Mảnh cắt bị bong, gấp quá nhiều:
Có thể do cố định bệnh phẩm không tốt: không khắc phục được hoặc phải lấy bệnh phẩm mới và làm lại kỹ thuật.
Do cắt quá dày hoặc dán mảnh cắt không tốt: cắt và dán lại mảnh cắt, nhuộm lại.
Mảnh cắt bị rách, nhăn hoặc giãn quá mức: do cắt bị vấp hoặc do dàn mảnh cắt quá mức hoặc bàn hơ quá nóng. Cần điều chỉnh nhiệt độ và cắt nhuộm lại nếu cần.
Nhân tế bào và chất nhày bắt màu yếu: tăng thời gian nhuộm.
Nhiều bọt khí, hơi nước trong tiêu bản: gắn lá kính thật nhanh, ngay khi nhấc qua bể toluen, thực hiện kỹ thuật trong phòng khô (có điều hòa, máy hút ẩm, đặc biệt vào những khi thời tiết có độ ảm cao).
Mảnh cắt bị khô, bay mất thuốc nhuộm, không đánh giá được: cần phủ kín mảnh cắt bằng lá kính, gắn đủ bôm hoặc chất gắn lá kính.
Những sai sót và xử trí khi nhuộm xanh alcian
Chất nhầy acid không bắt màu: kiểm tra lại để đánh giá chính xác độ pH của thuốc nhuộm.
Tùy thuộc chất nhày acid loại nào sẽ bắt màu ở các độ pH 1 hay 2,5, nên phải đánh giá sự bắt màu chất nhày theo loại mô được nhuộm.
