Ntm (nontuberculous mycobacteria) định danh real-time pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích 

Xác định DNA đặc trưng của NTM (Nontuberculous mycobacteria) trong mẫu bệnh phẩm của người.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Máy real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ly tâm lạnh

Tủ lạnh 2⁰C -8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰ C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Máy vortex

Tủ an toàn sinh học 

Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Đầu côn có phin lọc các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
1.		Lọ đựng bệnh phẩm vô trùng		Cái
2.		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
3.		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
4.		Găng không có bột tal (DNase-RNase free)		Đôi
5.		Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán		Test
	6.		Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng		Test
	7.		Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic		Test
	8.		Tube eppendorff 1,5 ml		Cái
	9.		Strip 8 tubes 0,1 ml		Cái
	10.		Nắp đậy strip 8 tubes		Cái
	11.		Đầu côn có phin lọc 1 ml		Cái
	12.		Đầu côn có phin lọc 200 µl		Cái
	13.		Đầu côn có phin lọc 10 µl		Cái
	14.		Giấy thấm không bụi		Cuộn
	15.		Giấy xét nghiệm		Tờ
	16.		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
	17.		Bút viết kính		Cái
	18.		Bút bi		Cái
	19.		Mũ		Cái
	20.		Khẩu trang		Cái
	21.		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
	22.		Quần áo bảo hộ		Bộ
	23.		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
	24.		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
	25.		Dung dịch khử trùng		ml
	26		Khăn lau tay		Cái
	27.		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Đờm, các dịch sinh học (dịch phế quản, dịch não t y, nước tiểu, phân…), mảnh sinh thiết…

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ   rên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh. 

Tiến hành kỹ thuật

Các bộ sinh phẩm (VD hoặc tương đương):

ExiPrep™ Dx Mycobacteria Genomic DNA Kit (Bioneer).

Accupower MTB & NTM Real-time PCR Kit (Bioneer)

Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).

Tách chiết dna, rna 

Thực hiện phản ứng real-time pcr

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh

Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR trước khi pha hóa chất. 

Chuẩn bị Master Mix

Cho chứng +, chứng – hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube Master Mix.

Cài đặt vị trí mẫu trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy realtime PCR.

Chọn các kênh màu phù hợp với từng tác nhân của mẫu, chứng dương và chứng âm.

Lưu file dữ liệu vào máy tính

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu nền và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang cho chứng nội dương tính hoặc  thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính

Phân tích mẫu

Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu FAM và máy báo DETECTED.  

Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính và và máy báo NON-DETECTED

Những sai sót và xử trí

Sự cố

Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục: Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.