PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
LY TÂM PHÂN LỚP THEO TỶ TRỌNG SỬ DỤNG FICOLL
(Stem cell isolation by density gradient method using Ficoll)
NGUYÊN LÝ
Dựa vào tỷ trọng của Ficoll và tỷ trọng của tế bào máu: tỷ trọng của Ficoll là 1,077, cao hơn tỷ trọng của bạch cầu lympho nhưng lại thấp hơn tỷ trọng của hồng cầu và bạch cầu hạt. Khi ly tâm, hồng cầu và bạch cầu hạt lắng xuống đáy ống ly tâm, còn bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân khác nằm ở trên lớp Ficoll. Thu hoạch lớp tế bào ở trên lớp Ficoll rất giàu tế bào gốc tạo máu.
Nguồn gốc: Theo quy trình của hãng Mass Miltenyi Biotec.
CHỈ ĐỊNH
Khối tế bào gốc tách từ máu ngoại vi;
Máu dây rốn;
Dịch hút tủy xương.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Kỹ thuật viên được đào tạo để thực hiện kỹ thuật.
Phương tiện – Hóa chất
Phương tiện:
Hốt vô trùng có đèn cồn;
Máy ly tâm lạnh có bucket văng cho ống Falcon 50 ml;
Pipet điện hút chân không;
Các ống đong thủy tinh 100, 250 ml (đã hấp khử trùng);
Các pipet paster thủy tinh (đã hấp khử trùng, 1 hộp);
Cốc thủy tinh (đã hấp sấy khử trùng, 02 cái);
Lưới thép mịn (đã hấp sấy khử trùng, 3 cái);
Các pipet thủy tinh hoặc nhựa vô khuẩn loại 10 – 20 ml (2 cái mỗi loại);
Máy ly tâm lạnh;
Quả bóp cao su dùng cho pipet pasteau (đã hấp khử trùng, 02 cái);
Ống tiêm 15 ml, 20 ml;
Kim 18G;
Bông cồn iod;
Hóa chất
Dung dịch Ficoll 1,077 vô trùng;
Mẫu nguyên liệu: dịch hút tủy xương, máu dây rốn, túi tế bào gốc tách từ máu ngoại
Hồ sơ: Hồ sơ xử lý cô đặc và tinh sạch tế bào gốc (1 bộ).
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Thời gian thực hiện: Càng sớm càng tốt, ngay khi mẫu được đưa đến labo;
Người thực hiện: kỹ thuật đi găng tay, đội mũ, đeo khẩu trang;
Tính số lượng ống Falcon 50 ml cần dùng (mỗi ống xử lý được 30ml máu/dịch hút tủy xương);
Khử trùng tay, găng tay bằng cồn ethanol 70o;
Lấy 1ml mẫu xét nghiệm trước xử lý để xét nghiệm: Tổng phân tích tế bào máu, tế bào CD34, tỷ lệ tế bào sống chết;
Pha loãng dịch xử lý đã chống đông với dung dịch PBS theo tỷ lệ 6: 1 (30 ml máu dây rốn/dịch hút tủy xương + 5 ml PBS);
Nếu dùng dịch hút tủy xương:
+ Lọc qua màng lọc 100 micromet để loại mảnh xương và xơ sợi;
+ Pha loãng 2 lần bằng dung dịch NaCl 0,9%.
Cho 15 ml Ficoll – Paque vào ống Falcon 50 ml. Nhẹ nhàng đặt 35 ml dịch đã pha loãng lên trên lớp Ficoll – Paque;
Ly tâm với lực 445g trong 30 phút, ở nhiệt độ 20oC;
Hút bỏ lớp huyết tương, và hút lớp nhẫn bạch cầu chuyển sang ống Falcon 50ml mới;
Rửa tế bào 2 lần bằng thêm 40 ml PBS, ly tâm 300g trong 10 phút, ở nhiệt độ 20oC; loại bỏ dịch nổi và giữ cặn tế bào;
Tái huyền dịch cặn tế bào trong 15 – 20 ml dung dịch nước muối sinh lý;
Lấy mẫu xét nghiệm sau xử lý 1ml để làm xét nghiệm: tổng phân tích tích tế bào máu, tế bào CD34, tỷ lệ tế bào sống chết;
Kết thúc quy trình:
Bàn giao sản phẩm và mẫu xét nghiệm;
Hoàn thiện và lưu hồ sơ thực hiện.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Miltenyl Biotec Inc. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by density gradient centrifugation. www.mitenylbiotec.com, 2008.
Ivan Roitt (1998). Density gradient seperation of lymphocyte on Ficoll isopaque. In Immunology 5th Edition by Ivan Roitt, Pub by Moskey, 1998, p.391.
