Nguyên lý
Mục đích
Phát hiện gene kháng thuốc có trong vi khuẩn gây bệnh.
Nguyên lý
Dựa trên trình tự nucleotide đặc trưng của gene mã hóa cho đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gene.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn Sinh học cấp 2.
Máy PCR.
Máy đọc điện di.
Máy giải trình tự gen.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Micropipette.
Bộ lưu điện.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 3 mẫu/lần thực hiện (VD)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
kg |
0,001 |
|
2 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
3 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
7 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
8 |
Găng không có bột (DNase-RNase free) |
Cái |
0,500 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại |
Test |
1,350 |
|
11 |
Kit tách chiết DNA |
Test |
2,350 |
|
12 |
DNA marker |
Bộ |
1,000 |
|
13 |
Primer 1 (bộ primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
14 |
Primer 2 (bộ primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
15 |
Primer 3 (bộ primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
16 |
Primer 4 (bộ primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
17 |
Ống Eppendorf 1,5 ml |
Tube |
3,000 |
|
18 |
Ống Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
1,000 |
|
19 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,000 |
|
20 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
21 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
22 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
23 |
Ethanol BDH |
ml |
0,500 |
|
24 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
25 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
26 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
27 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
28 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
29 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
30 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
31 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
32 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
33 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
34 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
35 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
36 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
37 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
38 |
Khăn lau tay |
cái |
0,010 |
|
39 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,100 |
|
40 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Bệnh phẩm hoặc chủng vi khuẩn cần tìm gene kháng thuốc.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục 3).
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết DNA tổng số.
Thực hiện PCR gene kháng thuốc.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Giải trình tự gene.
Kiểm tra sự thay đổi nucleotide của gene kháng thuốc và kết luận.
Nhận định kết quả
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gene đích được so sánh với các trình tự của gene của chủng hoang dại trên “Genebank” để xác định sự có mặt của các đột biến kháng thuốc.
Những sai sót và xử trí
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
