Nội dung

Vi khuẩn kháng thuốc pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn thông qua xác định sự có mặt của gene kháng thuốc ở vi khuẩn.  

Nguyên lý

Sử dụng cặp mồi có trình tự đặc hiệu để xác định sự có mặt của gene kháng thuốc trong vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật PCR.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn Sinh học cấp 2.

Máy PCR. 

Máy đọc điện di.

Máy ly tâm 25000 x g.

Máy ủ nhiệt.

Máy vortex.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.

Micropipette.

Bộ lưu điện.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện (VD).

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Bông 

kg

0,001

2

Cồn

ml

1,000

3

Bơm kim tiêm

Cái

1,000

4

Panh

Cái

0,0001

5

Khay đựng bệnh phẩm

Cái

0,0001

6

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Test

0,001

7

Tube đựng bệnh phẩm

Cái

2,000

8

Găng không có bột (DNase-RNase free)

Cái

0,500

9

Sinh phẩm chẩn đoán

Test

1,000

10

Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại

Test

1,350

11

Kit tách chiết DNA

Test

2,350

12

DNA marker

Bộ

1,000

13

Primer 1

ml

0,0001

14

Primer 2

ml

0,0001

15

Ống Eppendorf 1,5 ml

Tube

3,000

16

Ống Eppendorf 0,2 ml

Tube

1,000

17

Đầu côn 10 µl có lọc

Cái

1,000

18

Đầu côn 30 µl

Cái

1,200

19

Đầu côn 200 µl có lọc

Cái

2,200

20

Đầu côn 1 ml có lọc

Cái

3,200

21

Ethanol BDH

ml

0,500

22

Water-DEPC Treated

ml

2,000

23

Giấy thấm

Cuộn

0,100

24

Giấy xét nghiệm

Tờ

2,000

25

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Tờ

0,001

26

Bút viết kính

Cái

0,020

27

Bút bi

Cái

0,010

28

Cái

0,020

29

Khẩu trang

Cái

0,020

30

Găng tay

Đôi

0,100

31

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0,020

32

Quần áo bảo hộ

Bộ

0,005

33

Dung dịch nước rửa tay

ml

8,000

34

Cồn sát trùng tay nhanh

ml

1,000

35

Dung dịch khử trùng

ml

10,000

36

Khăn lau tay

cái

0,010

37

QC (nếu thực hiện) *

 

0,100

38

EQAS (nếu thực hiện) *

 

0,005

* Ghi chú: 

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Bệnh phẩm hoặc chủng vi khuẩn cần xác định đặc tính kháng thuốc.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục 3).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết DNA tổng số.

Thực hiện PCR.

Điện di kiểm tra sản phẩm.

Đánh giá và kết luận.

Nhận định kết quả

Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét, không bị đứt gẫy và có kích thước tương ứng với đoạn gene đích cần khuếch đại.

Những sai sót và xử trí

Khi kết quả khi chứng âm và/hoặc chứng dương không hợp lý, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, sau đó thực hiện lại xét nghiệm.