XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN BẰNG
KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR
(Phát hiện cùng lúc nhiều đột biến)
MULTIPLE GENE MUTATIONS DETECTION BY MULTIPLEX PCR
NGUYÊN LÝ
Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Vì vậy, trong trường hợp bệnh do nhiều đột biến và cần xác định các đột biến này thì nên sử dụng kỹ Multiplex PCR. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR cho phép phát hiện được đồng thời nhiều đột biến.
CHỈ ĐỊNH
Xét nghiệm này được chỉ định cho tất cả các người bệnh mắc bệnh máu do các đột biến gen.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm Sinh học phân tử đã được đào tạo.
Phương tiện – Hóa chất
Phương tiện
Máy PCR;
Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;
Buồng vô trùng (biology cabinet);
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
Máy vortex;
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
Đầu côn có màng lọc;
Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Tủ lạnh 4 – 8oC, tủ âm sâu – 20oC;
Găng tay.
Hóa chất
Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).
Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng.
Các cặp mồi đặc hiệu cho các đột biến cần xác định và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control).
Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.
Thuốc nhuộm ethidium bromide.
Bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.
Phiếu xét nghiệm
Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.
Tiến hành kỹ thuật
Bước 1. Tách chiết ADN
Xem bài “Tách chiết ADN từ máu ngoại vi”
Bước 2. Thực hiện phản ứng Multiplex PCR
Đưa các thành phần cần thiết của phản ứng ra nhiệt độ phòng 10 phút để rã đông hoàn toàn.
Trộn lẫn các thành phần sau vào một ống 0,2 ml: Buffer, dNTPs, MgCl2 (nếu trong Buffer chưa có), hỗn hợp mồi (gồm các cặp mồi phát hiện đột biến được trộn theo tỷ lệ nhất định), enzym Taq polymerase, nước khử ion vô trùng, ADN khuôn.
Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn.
Đặt vào máy PCR.
Chọn chương trình.
Bấm start để máy chạy.
Bước 3: Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose:
Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.
Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X…) vào bình, lắc đều.
Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.
Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.
Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.
Điện di:
Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH20
Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự
Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp
Đặt bản gel vào máy điện di
Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút
Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.
VII . NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
|
SAI SÓT |
XỬ TRÍ |
|
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông. |
Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu. |
|
Thao tác pipet không chính xác. |
Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định. |
|
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng. |
Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm. |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124 – 125.
A.Rolfs et at (1992). PCR: Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag, Berlin.
