Đại cương
Xét nghiệm FISH gọi là lai tại chỗ gắn huỳnh quang là xét nghiệm để xác định khuyếch đại gen Her-2/neu.
Chỉ định
Theo chỉ định của Bác sĩ lâm sàng: chủ yếu các định tình trạng khuyếch đại gen trong ung thư vú, ung thư dạ dày và một số loại để điều trị đích.
H a chất và trang thiết bị
Bộ kít PathVysion
Máy ThermoBrite
Kính hiển vi huỳnh quang
Các bước tiến hành
Chuẩn bị mẫu
Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên tiêu bản đã được tráng silan
Tiêu bản được ủ qua đêm ở nhiệt độ 560C
Đánh dấu vùng tế bào u xâm lấn băng bút kim cương.
Khử paraffin của tiêu bản
Nhúng tiêu bản vào xylen 3 lần, mỗi lần 5 phút
Khử nước bằng cồn 900, 2 lần, mỗi lần 5 phút
Làm khô tiêu bản ở 450C: 2-5 phút
Rửa nước cất 1 lần: 3 phút
Rửa tiêu bản bằng dung dịch buffer 1 lần: 3 phút
Nhúng tiêu bản trong dung dịch rửa buffer nhiệt độ 800C: 30 phút
Rửa nước cất 1 lần: 1 phút
Tửa tiêu bản bằng dung dịch rửa buffer nhiệt độ phòng 2 lần, mỗi lần 5 phút.
Xử trí protease
Tiêu bản được lau khô các vùng nước đọng
Ngâm lam trong dung dịch protease: 10-60 phút nhiệt độ 370C
Rửa lam bằng dung dịch rửa buffer 2 lần mỗi lần 5 phút.
Làm khô tiêu bản ở 450C: 2-5 phút
Khử nước
Cồn 700: 1 phút nhiệt độ phòng
Cồn 850: 1 phút nhiệt độ phòng
Cồn 1000: 1 phút nhiệt độ phòng
Làm khô tiêu bản 450C: 2-5 phút
Tách dna và lai đồng thời
Dùng máy ThermoBite, thực hiện công đoạn trong buồng tối
Làm ấm lọ chứa đoạn đầu dò bằng máy lắc
Lấy 5 àl đoạn dò nhỏ lên vùng ung thư xâm nhập đã được đánh dấu
Gắn lamen kích thước 22 mm x 22 mm, phủ mép lamen bằng nhựa cao su
Kích hoạt chương trình
Tách DNA 750C: 5 phút
Lai đoạn dò DNA đích 370C: 18 giờ đảm bảo buồng lai tối
Tạo môi trường ấm, đạy nắp và bắt đầu
Rửa sau khi lai (thực hiện công việc trong buồng tối)
Làm nóng dung dịch rửa sau lai ở 720C
Chuẩn bị một lọ dung dịch rửa sau lai ở nhiệt độ phòng
Nhúng tiêu bản vào lọ dung dịch sau lai ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ để lamen rời ra
Lau những giọt nước đọng trên tiêu bản
Nhúng tiêu bản vào dung dịch sau lai ở nhiệt độ 720C: 2 phút
Lau khô tiêu bản trong buồng tối.
Nhuộm màu tương phản nhân
Nhỏ 5 àl DAPI vào vùng đã chọn
Dán lamen
Khảo sát tiêu bản
Bảo quản tiêu bản vào hộp giấy bạc, giữ ở -200C, ít nhất 30 phút trước khi khảo sát;
Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang có nhiều kính lọc các bước huỳnh quang.
Đánh giá kết quả
Đánh giá kết quả dựa vào tín hiệu màu vàng và tín hiệu màu xanh. Đếm 20 nhân tế bào vùng xâm nhập, không chống lên nhau
Tỉ lệ Her-2/CEP17
Tỉ lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
Tỉ lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17
Tỉ lệ 2,5
Tỉ lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
Số lượng tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.
