Vi khuẩn nuôi cấy và định danh phương pháp thông thường

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện và định danh vi khuẩn gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển. 

Nguyên lý

Vi khuẩn được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và có thể kết hợp với tính chất kháng nguyên.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Kính hiển vi quang học.

Tủ ấm thường.

Tủ ấm CO₂.

Máy tính cài phần mềm đọc API (nếu có).

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Lọ lấy bệnh phẩm	Lọ	1,000
2	Que cấy	Cái	1,000
3	Lam kính	Cái	2,000
4	Dầu soi kính	ml	1,000
5	Cồn 96 độ lau kính	ml	1,000
6	Nước muối sinh lý	ml	5,000
7	Thuốc nhuộm đỏ fuchsin	ml	5,000
8	Thuốc nhuộm tím gentian	ml	5,000
9	Cồn tẩy 95 độ	ml	10,000
10	Lugol	ml	5,000
11	Thuốc nhuộm xanh methylen	ml	5,000
12	Môi trường nuôi cấy	Đĩa	1,500
13	Bộ sinh vật hóa học (bộ API …)	Test	0,500
14	Bông	Kg	0,001
15	Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ)	ml	10,000
16	Đèn cồn	Cái	0,0001
17	Panh	Cái	0,0001
18	Khay đựng bệnh phẩm	Cái	0,0001
19	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Cái	0,0001
20	Mũ	Cái	0,020
21	Khẩu trang	Cái	0,020
22	Găng tay	Đôi	3,000
23	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi	0,020
24	Quần áo bảo hộ	Bộ	0,001
25	Acid ngâm lam	ml	10,000
26	Ống nghiệm thủy tinh	Ống	1,000
27	Bút viết kính	Cái	0,020
28	Bút bi	Cái	0,010
29	Bật lửa	Cái	0,010
30	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
31	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	1,000
32	Dung dịch nước rửa tay	ml	8,000
33	Khăn lau tay	Cái	0,030
34	Giấy trả kết quả xét nghiệm	Tờ	2,000
35	QC (nếu thực hiện) *		0,1
36	EQAS (nếu thực hiện) *		0,005

Môi trường nuôi cấy và hóa chất định danh vi khuẩn được tính trên tỉ lệ dương tính trung bình là 50 % cho các loại bệnh phẩm.

* Ghi chú: 

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Tất cả các loại bệnh phẩm được chỉ định nuôi cấy tìm vi khuẩn gây bệnh.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1).

Tiến hành kỹ thuật

Nhuộm soi bệnh phẩm, đánh giá sơ bộ.

Nuôi cấy bệnh phẩm vào môi trường phân lập. 

Ủ ấm qua đêm.

Bắt khuẩn lạc nghi ngờ. 

Nhuộm soi, thử nghiệm các thử nghiệm sinh vật hóa học đơn giản và định danh bằng các bộ sinh vật hóa học (bộ API …).

Nhận định kết quả

Dương tính: Phân lập và định danh được vi khuẩn gây bệnh. Trả kết quả tên vi khuẩn đến mức độ chi và/hoặc loài.

Âm tính: Không tìm thấy hoặc không phân lập được vi khuẩn gây bệnh.

Những sai sót và xử trí

Quy trình này chỉ áp dụng tìm vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện dễ nuôi cấy, không áp dụng cho các vi khuẩn kỵ khí bắt buộc. Kết quả âm tính không có nghĩa là không có vi khuẩn gây bệnh trong bệnh phẩm mà là không tìm thấy căn nguyên vi khuẩn gây bệnh có thể phân lập được bằng quy trình nuôi cấy này. 

Nếu có yêu cầu tìm căn nguyên vi khuẩn hiếm gặp, phải ghi yêu cầu cụ thể.

Bệnh phẩm lấy, vận chuyển và bảo quản không đúng yêu cầu có thể đưa đến kết quả âm tính hoặc dương tính giả (Xem Phụ lục 6).