TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÁU NGOẠI VI/ TỦY XƯƠNG
RNA ISOLATION FROM PERIPHERAL BLOOD AND BONE MARROW SAMPLES
NGUYÊN LÝ
ARN thông tin quy định các thông tin về axit amin và nằm trong tế bào chất của tế bào. Để tách được ARN người ta thường sử dụng các chất tẩy mạnh để phá màng tế bào, kết hợp với sử dụng các chất biến tính mạnh để loại bỏ các protein sau đó sử dụng cồn 96º kết hợp với điều kiện nhiệt độ thấp để thu được ARN một cách tinh sạch và nguyên vẹn.
CHỈ ĐỊNH
Sử dụng cho tất cả người bệnh có chỉ định làm xét nghiệm RT – PCR/qRTPCR.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo;
Tất cả các mẫu bệnh phẩm có chỉ định xét nghiệm RT – PCR hoặc qRTPCR.
Phương tiện – Hóa chất
Phương tiện
Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
Buồng vô trùng (biology cabinet);
Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);
Máy vortex;
Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
Đầu côn có màng lọc;
Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
Tủ lạnh 4 – 80C, tủ âm sâu – 200C;
Găng tay.
Hóa chất
Sử dụng kit tách ARN thương mại. Nếu tách thủ công thì sử dụng các sinh phẩm cần thiết để tách chiết ARN như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
2ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA.
Tiến hành kỹ thuật
Phương pháp tách chiết ARN cơ bản bao gồm các giai đoạn chính sau:
Loại bỏ các tế bào hồng cầu
ARN nằm ở tế bào chất bên trong các tế bào có nhân. Vì vậy thông thường bệnh phẩm sẽ được xử lý trước để loại bỏ bớt các tế bào hồng cầu. Để loại bỏ các tế bào hồng cầu có thể sử dụng dung dịch Ficoll (có tỷ trọng 1.077) để phân lớp các tế bào theo tỷ trọng hoặc sử dụng một số dung dịch ly giải hồng cầu (như dung dich gồm 1M MgCl2, 5M NaCl, 1M Tris – HCl). Sau khi loại bỏ bớt các tế bào hồng cầu, dung dịch còn lại chứa chủ yếu các tế bào có nhân sẽ được sử dụng để tách ARN.
Phá màng tế bào và màng nhân:
Các tế bào có nhân được ủ trong một dung dịch gồm chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl), một chất gây biến tính protein mạnh như (guanidinium thyocianat), một chất khử (2 – mercaptoethanol). Mục tiêu của bước ủ này là để phá màng tế bào đồng thời để ức chế hoạt động của các enzym phân hủy ARN nội bào (ARNaza) và tách các protein lên kết khỏi phân tử ARN.
Loại bỏ các protein:
Sử dụng dung dịch phenol/chloroform để biến tính protein, làm cho protein tạo thành một lớp tủa rõ rệt sau khi ly tâm, dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch
Kết tủa ARN:
Sử dụng cồn tuyệt đối để tủa ARN trong điều kiện đông lạnh và thu nhận lại ARN bằng ly tâm. ARN cần phải hòa lại trong nước khử enzym nucleaza.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sử dụng 5 µl ARN thu được để điện di kiểm tra trên gel agarose 0,5 – 0,8%, đồng thời kiểm tra độ sạch bằng đo quang phổ (A260/A28). Chất lượng ARN tốt nếu xuất hiện ba băng điện di tương ứng với 3 loại ARN 28S, 18S và 5,8S; tinh sạch nếu A260/A280 trong khoảng 1,8 – 2,0.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
|
SAI SÓT |
XỬ TRÍ |
|
Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông. |
Thực hiện theo đúng hướng dẫn qui cách lấy mẫu. |
|
Thao tác pipet không chính xác. |
Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định. |
|
Tín hiệu phản ứng không rõ ràng. |
Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất Thực hiện đúng, đủ các bước trong quy trình xét nghiệm |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Hồ Huỳnh Thuỳ Dương (1997). Các phương pháp tách chiết axit nucleic. Sinh học phân tử. NXB Giáo Dục, trang 124 – 125.
A.Rolfs et at (1992). PCR: Clinical Diagnosis and Research. Springer Verlag, Berlin.
