Nguyên tắc
Đây là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp. Nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần. Các phiến đồ bảo quản được lâu dài, nhưng không tốt bằng nhuộm Papanicolaou.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Phương tiện, hóa chất
Dung dịch cố định phiến đồ (cồn ete tỷ lệ 1/1 hoặc cồn 95 độ).
Cồn (700, 800, 900, 950,1000).
Cồn – acid 0,5% (5ml HCl với 1000ml cồn 50 độ).
Xylen (toluen).
Nước cất 2 lần.
Lá kính sạch.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Hốt phòng thí nghiệm.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xy len.
Giá đựng phiến đồ (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Giấy lọc.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Nguồn cấp nước chảy.
Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
Phẩm nhuộm: phẩm nhuộm nhân và bào tương có thể mua dạng thương mại, dùng luôn. Nếu không có sản phẩm dùng ngay, có thể pha phẩm nhuộm theo cách thức dưới đây:
Hematoxylin Harris
|
Hematoxylin (tinh thể) |
|
1g |
|
Cồn (Etanol) tuyệt đối |
|
10ml |
|
Alun (ammonium hay potassium) |
|
20g |
|
Nước cất |
|
200ml |
|
Oxyt thuỷ ngân (đỏ) |
|
0,5g |
Tiến hành pha:
Hoà tan hematoxylin trong cồn.
Hoà tan alun trong nước cất nóng. Đưa ra khỏi lửa và trộn hai dung dịch với nhau.
Đun sôi hỗn hợp, kéo bình đun ra khỏi lửa và thêm dần vào oxyt thuỷ ngân.
Đun nóng lại, khi hỗn hợp có màu tím sẫm, tắt lửa và nhúng ngay bình đun vào nước lạnh.
Khi bình đun lạnh hẳn, thêm 2ml acid acetic lạnh để làm tăng tính nhuộm nhân.
Eosine Y: ở Việt Nam, thường pha dung dịch 0,5% trong cồn 95o. L.G. Koss pha theo công thức :
Eosin Y (CI. No 45830) 16g hoặc 1g
Dichromat kali 8g hoặc 0,5g
Acid picric (nước bão hoà) 160ml hoặc 10ml
Cồn etanol 95o 160ml hoặc 10ml
Nước cất 1280 ml hoặc 80ml
Hoà tan eosin và dichromat kali vào nước cất, đun nóng nếu cần, sau đó thêm dung dịch acid picric, cồn.
Các bước tiến hành
Thực hiện các bước sau:
Phiến đồ để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng.
Cố định phiến đồ trong cồn 95 độ từ 5-10 phút.
Để khô tự nhiên.
Rửa qua nước.
Nhuộm Hematoxylin trong 3-5 phút.
Rửa nước trong 5 phút.
Biệt hóa trong cồn – acid 0,5% trong 1 vài giây.
Rửa nước trong 10-15 phút.
Nhuộm eosin trong 1 phút Rửa nước.
Loại phẩm thừa bằng cồn 95 độ.
Khử nước bằng xylen
Gắn lá kính bằng bôm Canada.
Kết quả
Nhân tế bào xanh đến xanh đen
Bào tương tế bào hồng đến đỏ
Hồng cầu hồng đậm
Sợi tạo keo hồng nhạt.
Những sai sót và hướng xử trí
Bào tương và nhân đều bắt màu nhạt: thuốc nhuộm cũ, thay thuốc nhuộm mới.
Nhân nhạt màu: tăng thời gian nhuộm nhân.
Nhân đậm màu quá mức: tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
