Các xét nghiệm đông máu: xét nghiệm yếu tố bằng hai giai đoạn và tạo máu

Kết quả xét nghiệm FVIII bởi phương pháp 2 giai đoạn và tạo màu là tương đương nhau. Đối với hầu hết bệnh nhân, kết quả xét nghiệm FVIII từ cả 3 phương pháp (1 giai đoạn, 2 giai đoạn, tạo màu) là có thể so sánh. Tuy nhiên có một số tình huống mà có sự khác biệt trong kết quả được thực hiện bởi phương pháp 1 giai đoạn so với 2 phương pháp còn lại.

Sự khác biệt lớn (lên đến thấp hơn 40% với xét nghiệm 1 giai đoạn) giữa phương pháp 1 giai đoạn so với 2 phương pháp còn lại đã được báo cáo ở huyết tương bệnh nhân sau truyền FVIII tái tổ hợp. Điều này có thể vượt qua bằng cách sử dụng một chuẩn tham chiếu FVIII tái tổ hợp thay vì chuẩn huyết tương cho xét nghiệm 1 giai đoạn trong trường hợp này.

Một số đột biến trong gene F8 tạo ra kết quả chênh lệch, đặc biệt là cản trở tương tác với domain A1 và A2. Có 3 type: a/ Mức FVIII cao hơn 2 lần ở PP 1 giai đoạn so với PP còn lại; b/ Mức FVIII cho ra bình thường ở PP 1 giai đoạn; c/ Mức FVIII cao hơn 2 lần ở PP 2 giai đoạn/tạo màu so với 1 giai đoạn. Và kiểu hình chảy máu thường tương ứng với phương pháp 2 giai đoạn/tạo màu.

Độ thay đổi màu trong phương pháp tạo màu có thể đo rất chính xác và tỷ lệ trực tiếp với lượng Xa. Vì vậy nó phù hợp trong trường hợp xác định mức yếu tố rất thấp hoặc rất cao.

Phương pháp này nhìn chung sử dụng một mức pha loãng cao hơn, làm cho nó không nhạy với các LA, heparin, lepirudin, hoặc những chất ức chế; trong khi đó, tất cả những yếu tố này tương tác lớn trong xét nghiệm 1 giai đoạn.

Phương pháp tạo màu hiện nay được xem là phương pháp quyết định nồng độ FVIII có hiệu lực, được khuyến cáo bởi European Pharmacopoeia và ISTH Subcommittee

Giới thiệu

Phương pháp 2 giai đoạn hiếm thực hiện ngày nay nhưng vẫn là một xét nghiệm quan trọng. Xét nghiệm này đã được thay thế trong nhiều trường hợp bằng phương pháp tạo màu. Nếu chúng ta xem xét định mức FVIII, xét nghiệm 1 giai đoạn thực hiện tương đối đơn giản và chính xác. Nhưng hạn chế của nó bao gồm độ nhạy với các yếu tố nhiễu tiền hoạt hóa yếu tố VIII hoặc kháng thể kháng phospholipid cũng như kết quả nhầm lẫn khi có FVIII tái tổ hợp. Thêm vào đó một số đột biến gene F8 dẫn đến khác biệt kết quả giữa phương pháp 1 giai đoạn so với phương pháp 2 giai đoạn/ tạo màu.

Nguyên lý và phương pháp

Phương pháp xét nghiệm fviii 2 giai đoạn 

Phương pháp này tương tự như phương pháp tạo màu, nó liên quan đến một bước ủ để tạo ra FXa và giai đoạn 2 xác định số lượng FXa được tạo ra.

Cần chuẩn bị: 

Huyết tương hấp phụ của bệnh nhân được trộn với huyết tương hoạt hóa, FV, CaCl2 và Phospholipid để khởi động đông máu và tạo ra FXa. Sau một thời gian ủ cố định, một phần của hỗn hợp tạo thành được cho vào một phần huyết tương bình thường và thời gian cục đông được ghi lại. Thời gian cục đông được biểu diễn trên biểu đồ Log-Log và từ đó mức FVIII được suy ra. 

Huyết tương bệnh nhân được hấp phụ để loại bỏ prothrombin và ngăn sự tạo thành cục đông khi dòng thác đông máu khởi động. Cục đông bắt đầu khi thêm FIXa, FX và FV được cung cấp một lượng dư. Mức FVIII là yếu tố giới hạn sự tạo thành Xa. Đây là giai đoạn 1 của xét nghiệm. Ở giai đoạn 2, một mẫu của hỗn hợp ở giai đoạn 1 được cho vào huyết tương bình thường và thời gian cục đông được ghi lại. Vì thời gian cục đông tạo thành sẽ phụ thuộc vào mức FXa trong mẫu ở giai đoạn 1 và mức FXa lại tỷ lệ với nồng độ FVIII trong huyết tương bệnh nhân, vì vậy mức FVIII có thể suy ra từ thời gian tạo ra trong giai đoạn 2.

Phương pháp xét nghiệm fviii bằng tạo màu

Tương tự phương pháp 2 giai đoạn trên, với giai đoạn 1 tạo FXa và giai đoạn 2 xác định lượng FXa tạo ra. Trong phương pháp này, lượng FXa được đo bởi khả năng của nó tương tác với cơ chất tạo màu đặc hiệu cao và vì vậy cường độ màu tạo được tỷ lệ trực tiếp với lượng FXa, suy ra tỷ lệ trực tiếp với FVIII, mức FVIII có thể được tính từ độ hấp thụ bước sóng đặc hiệu của mẫu.

Chuẩn bị cần:

Huyết tương bệnh nhân được ử với thuốc thử “cocktail” ở 37 độ C. Thrombin trong hỗn hợp thuốc thử sẽ hoạt hóa FVIII thành FVIIIa và trong sự có mặt của Calcium, Phospholipid, chúng hoạt động như là đồng yếu tố (co-factor) của FIXa để chuyển FX thành FXa. FVIII làm giới hạn tỷ lệ ở bước này. Cơ chất tạo màu được thêm vào. Sau ủ 1 giây, độ hấp thụ của bước sóng đặc hiệu được đo và so với đường cong tham chiếu mức FVIII.

Đường cong tham chiếu được vẽ bởi độ hấp thụ bước sóng 405nm so với nồng độ trên một đường thẳng trong đồ thị.

Phân tích kết quả

Xem phần bình luận về sự khác biệt của xét nghiệm FVIII 1 và 2 giai đoạn

Khoảng tham chiếu

Mức tham chiếu FVIII nằm giữa 50-150% [50-150 IU/dL hoặc 0.5-1.50 IU/mL]. Khoảng tham chiếu ở trẻ sơ sinh rất tương tự người lớn.

Tài liệu tham khảo

Keeling, D.M., Sukhu, K., Kemball-Cook, G., Waseem, N., Bagnall, R. & Lloyd, J.V. (1999) Diagnostic importance of the two-stage factor VIII:C assay demonstrated by a case of mild haemophilia associated with His1954–>Leu substitution in the factor VIII A3 domain. Br J Haematol, 105, 1123-1126.

Kirkwood, T.B. & Barrowcliffe, T.W. (1978) Discrepancy between one-stage and two- stage assay of factor VIII:C. Br J Haematol, 40, 333-338.

Rodgers, S.E., Duncan, E.M., Barbulescu, D.M., Quinn, D.M. & Lloyd, J.V. (2007) In vitro kinetics of factor VIII activity in patients with mild haemophilia A and a discrepancy between one-stage and two-stage factor VIII assay results. Br J Haematol, 136, 138-145.