Nguyên lý
RIA-gnost AFP cho phép xác định alpha-fetoprotein trong huyết thanh (hoặc huyết tương) người vá trong dịch ối với nguyên lý “bánh kẹp” (sandwich). Một phức hợp sẽ được hình thành trong quá trình tiến hành phản ứng, gồm các kháng thể kháng AFP (dơn dòng, sản xuất trên chuột bạch) được gắn vào thành ống nghiệm, AFP có trong mẫu thử, và kháng thể kháng AFP-125I (đơn dòng, chuột bạch). Lượng kháng thể đánh dấu gắn đặc hiệu vào thành ống nghiệm sẽ đo trên máy đếm gamma.
Đánh giá hàm lượng AFP của các mẫu xét nghiệm chưa biết nồng độ được thực hiện bằng cách đọc trên đường cong chuẩn được làm trong cùng điều kiện như nhau. Tất cả các mẫu nằm ngoài phạm vi đo, cũng như các mẫu dịch ối, được hòa loãng 1:100 với dung dịch pha loãng cho trong hộp Kit.
Các kháng thể đơn dòng được sử dụng là rất đặc hiệu với AFP. Sự thực là không có nguy cơ xảy ra phản ứng chéo với các protein huyết thanh khác có trong các phạm vi nồng độ sinh lý tương ứng.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Bác sỹ chuyên ngành Y học hạt nhân
Kỹ thuật viên Y học hạt nhân
Cán bộ hóa dược phóng
Điều dưỡng Y học hạt nhân
Phương tiện, hoá chất
Phương tiện
Máy trộn (vortex type mixer), Máy lắc ngang (shaker) 200-350 rpm, thường dùng là 300 rpm, Máy đếm Gamma,Micropipette: 50μl, 200μl Multipette: 500 μl, 2000μl, Giá gắn ống nghiệm (tubes), Giấy thấm.
Hoá chất
Lọ kháng thể đơn dòng AFP- 125I(Tracer): lọ 22ml, chứa 125I – AFP antibody đơn dòng, hoạt độ phóng xạ
05 lọ mẫu huyết thanh AFP chuẩn có nồng độ từ 4 – 800 IU/mL (Standards), mỗi lọ 0,3 mL, trực dụng.
02 lọ huyết thanh AFP giám sát (Control serum) có hai nồng độ khác nhau, thể tích mỗi lọ 0,3mL, trực dụng.
01 lọ dung dịch huyết thanh chuẩn có nồng độ 0 IU/mL, thể tích 30mL, màu xanh, dung pha loãng, trực dụng.
Dung dịch đệm rửa (Wash buffer) : 05 viên, mỗi viên pha 100mL nước cất trước khi dùng.
Ống nghiệm tráng kháng thể đa dòng kháng AFP ở đáy ống: 100 ống, trực dụng.
Chỉ định
Những người bệnh bị bệnh lý gan – mật
Chống chỉ định:
Không có.
Chuẩn bị
Đưa thuốc thử và mẫu bệnh phẩm ra nhiệt độ phòng (18-250C) tối thiểu 20’ trước khi dùng.
Đánh số kép lên các ống nghiệm(Total, Chuẩn (Standards – St), huyết thanh giám sát (Control serum – CS), bệnh phẩm – P).
Trộn đều thuốc thử, mẫu chuẩn… tránh bọt.
Phiếu xét nghiệm chỉ định định lượng AFP bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ.
Các bước tiến hành
Tách lấy 0,5 ml huyết thanh.
Tiến hành kỹ thuật:
Cho 50 μl huyết thanh chuẩn, huyết thanh giám sát, bệnh phẩm vào các ống thí nghiệm tương ứng, trừ ống T.
Cho 200 μl dung dịch pha loãng -Diluent D (xanh lam) vào tất cà ống, trừ ống T.
Cố định các giá đựng ống nghiệm trên máy shaker, lắc ngang ở nhiệt độ phòng với thời gian 15’.
Gạn bỏ dịch nổi, úp ngược trên giấy thấm 2 phút.
Cho 1.000 μl kháng thể đơn dòng AFP- 125I -Tracer (đỏ) vào tất cả các ống.
Cố định các giá đựng ống nghiệm trên máy shaker, lắc ngang ở nhiệt độ phòng với thời gian 15’.
Gạn bỏ dịch nổi, úp ngược trên giấy thấm 2 phút.
Đo mẫu trên máy đếm Gamma với thời gian đo 01 phút.
Tính hàm lượng mẫu dựa vào dãy chuẩn, kiểm tra control serum, precision profile bằng phần mềm xử trísố liệu chuyên dụng.
Nhận định kết quả
Mỗi phòng xét nghiệm tự xây dựng khoảng giá trị kết quả tham khảo cho chính phòng mình. Kết quả dưới đây là của hãng sản xuất CIS- Bio.
|
Nồng độ AFP IU/Ml |
Nhận định kết quả |
|
|
Âm tính |
|
|
Dương tính |
Những sai sót và xử trí
Sai xót chủ quan & khách quan
Cho mẫu huyết thanh hoặc kháng nguyên phóng xạ vào các ống nghiệm bị bỏ xót.
Độ chênh lệch số xung phóng xạ giữa hai ống kép chênh lệch nhau > 10% ( CV > 10%) do sai sót khi đưa mẫu hoặc kháng nguyên hay kháng thể gắn phóng xạ vào ống nghiệm.
Sai lệch thể tích của Micropipet; Hoạt độ riêng của chất đánh dấu phóng xạ với kháng nguyên & kháng thể thấp hơn quy chuẩn.
Số xung đo phông của các giếng đếm phóng xạ cao và không ngang bằng nhau.
Khắc phục
Tập trung khi triển khai làm, sau khi cho mẫu xong cần đưa ống nghiệm cao ngang tầm mắt để quan sát đáy các ống để bổ xung mẫu bỏ sót.
Những mẫu có CV>10% phải tiến hành làm lại; Định kì phải kiểm chuẩn độ chính xác của Micropipet; Triển khai định kỳ nội kiểm và ngoại kiểm với các lab trong nước và trên thề giới; Kiểm tra hoạt độ thuốc phóng xạ với chất gắn và kiểm tra chất lượng thiết bị.
Nồng độ chất cần định lượng quá cao không được ngoại suy mà nên pha loãng huyết thanh mẫu & định lượng lại để khắc phục “hiệu ứng móc”.
