ĐỌ CHÉO TRONG GHÉP BẰNG KỸ THUẬT PHÂN
TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY (FLOW CYTOMETRY)
(flow cytometry lympho cross – match test)
NGUYÊN LÝ
Bệnh nhân có thể đã mẫn cảm với các kháng nguyên hệ HLA đồng loài từ trước hoặc bị mẫn cảm với kháng nguyên hệ HLA trong quá trình điều trị trước ghép đồng loài (ghép tạng hoặc ghép tế bào gốc tạo máu). Khi đó trong máu bệnh nhân có thể sẽ hình thành các kháng thể miễn dịch đặc hiệu chống lại HLA đã mẫn cảm. Nếu trong máu bệnh nhân ghép có kháng thể đặc hiệu chống lại HLA người cho thì kết quả sau ghép rất xấu, thường bị thải ghép tối cấp. Để tránh tình trạng thải ghép tối cấp, trước khi ghép cần làm xét nghiệm đọ chéo nhằm phát hiện trong máu bệnh nhân dự kiến ghép có kháng thể đặc hiệu kháng lại HLA người cho hay không. Kháng nguyên hệ HLA có 2 lớp, HLA lớp 1 và HLA lớp 2. HLA lớp 1 xuất hiện trên bề mặt tất cả các tế bào có nhân, HLA lớp có mặt chủ yếu trên các tế bào lympho B, tế bào mono, và tế bào tua gai (dendritic cell). Do vậy nếu ủ huyết thanh bệnh nhân (người nhận) với lympho người cho, kháng thể đặc hiệu HLA lớp 1 và/hoặc lớp 2 (nếu có) sẽ gắn lên bề mặt tế bào lympho (lympho T và/hoặc lympho B) người cho. Xét nghiệm đọ chéo lympho dùng để phát hiện kháng thể kháng HLA của người nhận ghép trong lựa chọn người cho, trong theo dõi phản ứng sau ghép. Để xét nghiệm đọ chéo lympho trước kia người ta hay dùng kỹ thuật vi độc tế bào lympho. Tuy nhiên hiện nay do tính ưu việt về độ nhạy, độ chính xác, và tốc độ phân tích, kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy được dùng nhiều hơn.
CHỈ ĐỊNH
Bệnh nhân trước ghép và sau ghép tạng, ghép tủy.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
Phương tiện – Hóa chất
Phương tiện
Máy phân tích tế bào dòng chảy (4 màu huỳnh quang trở lên);
Máy ly tâm ống máu;
Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl;
Các ống vi ly tâm (ống Eppendorf)1,5 ml.
Găng tay.
Hóa chất
Dung dịch đệm PBS;
Hỗn hợp kháng thể CD45/CD3/CD19/anti Human IgG, mỗi loại kháng thể gắn 1 màu huỳnh quang khác nhau;
Dung dịch ly giải hồng cầu;
Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
Bệnh phẩm
Bệnh phẩm cần lấy là mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân và của người cho.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
Lấy 2 ml máu chống đông bằng EDTA của người cho.
Lấy 2 ml máu đông của bệnh nhân và 2 ml máu đông của người cho.
Tiến hành kỹ thuật
Chuẩn bị tế bào người cho:
+ Lấy 100 µl máu toàn phần người cho vào mỗi ống vi ly tâm 1,5 ml (cần làm 2 ống).
+ Thêm 1000 µl dung dịch ly giải hồng cầu, ủ nhiệt độ phòng 10 phút.
+ Ly tâm 3000 vòng/phút x 3 phút, đổ bỏ dịch nổi, giữ cặn tế bào.
+ Thêm 1 ml dung dịch PBS, tái huyền dịch cặn tế bào, ly tâm rửa 3000 vòng/phút x 3 phút, đổ bỏ dịch nổi
Chuẩn bị huyết thanh bệnh nhân và huyết thanh người cho: ly tâm ống máu đông, tách huyết thanh.
Ủ huyết thanh bệnh nhân hoặc huyết thanh người cho với tế bào người cho.
+ Nhỏ 100 µl huyết thanh bệnh nhân hoặc huyết thanh người cho vào các ống Eppendorf chứa tế bào người cho. Trộn đều và ủ 37oC trong 1 giờ. Ống ủ huyết thành bệnh nhân với tế bào người cho là ống thử phát hiện kháng thể kháng HLA, ống ủ huyết thanh người cho với tế bào người cho là ống tự chứng. + Thêm 1 ml PBS, trộn đều trong 15 giây. Ly tâm 3000 vòng/phút x 3 phút. Hút bỏ dịch nổi. Lặp lại quy trình trên 2 lần
Ủ kháng thể: Nhỏ 20 µl hỗn hợp kháng thể anti CD45/anti CD3/anti CD19/anti human IgG, ủ 20 phút nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
Phân tích: Phân tích flow cytometry bằng chương trình Cross match đã lập sẵn trên máy flow cytometry.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Đọc kết quả
Đọc kết quả ở các vùng lympho T và lympho B. Kết quả âm tính khi quần thể tế bào cần phân tích nằm trong vùng âm tính. Kết quả dương tính khi quần thể tế bào phân tích nằm trong vùng dương tính, có thể biểu hiện kết quả bằng tỷ lệ % quần thể phân tích nằm trong vùng dương tính.
Nhận định kết quả
Bình thường: đọ chéo lympho B và lympho T đều âm tính.
Có kháng thể thường trực kháng lympho người cho: đọ chéo lympho B dương tính và/hoặc đọ chéo lympho T dương tính.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy xét nghiệm và trên ống mẫu không thống nhất, mẫu bị đông, mẫu không ghi giờ lấy.
Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại các thông tin cần thiết, nếu mẫu bị đông hoặc đã để quá lâu thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
Các vùng tế bào lympho không nằm trong cửa sổ chương trình chạy. Nguyên nhân có thể do thực hiện không đúng, lượng kháng thể ủ không đủ, thực hiện không đủ các bước của quy trình, ủ không đủ thời gian, hút pipet không tốt, tắc kim hút trên máy…
Xử trí: Làm lại xét nghiệm và tuân thủ theo đúng quy trình. Kiểm tra máy trước khi phân tích, phải rửa máy, đuổi bọt khí và thông kim hút (nếu cần) theo hướng dẫn đi theo máy.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Harmer A.W., Garner S., Bell A.E. et al. 1996. Evaluation of the flow cytometric crossmatch. Preliminary results of a multicentre study. Transplantation 61, 1108 – 11.
Beckman Coulter. 2011. IOTest CD45 Used manual
Beckman Coulter. 2011. IOTest CD3 Used manual
Beckman Coulter. 2011. IOTest CD19 Used manual
Beckman Coulter. 2011. IOTest Human IgG Used manual
