Đại cương
Kỹ thuật mô học thường quy nhuộm HE là một kỹ thuật cơ bản nhất giúp cho chẩn đoán mô bệnh học.
Chỉ định
Các trường hợp được sinh thiết nội soi, bệnh phẩm phẫu thuật cần có chẩn đoán mô bệnh học
Các bước tiến hành
Quy trình chuyển bệnh phẩm bằng tay
Áp dụng cho các bệnh phẩm có chiều dày
|
Cồn 900 |
15 phút |
|
Cồn 950 |
15 phút |
|
Cồn 1000 I |
15 phút |
|
Cồn 1000 II |
15 phút |
|
Cồn 1000 III |
15 phút |
|
Xylen I |
15 phút |
|
Xylen II |
30 phút |
|
Xylen III |
30 phút |
Paraffin I 30 phút – Paraffin II 1 giờ – Paraffin III 1 giờ.
|
Chú ý : Bệnh phẩm phải lắc liên tục và hoá chất phải mới. Áp dụng cho các bệnh phẩm dày 5 – 8 mm: |
|
|||
|
Cồn 800 |
2 giờ |
|||
|
Cồn 900 |
6 giờ |
|||
|
Cồn 950 |
8 giờ |
|||
|
Cồn 1000 I |
4 giờ |
|||
|
Cồn 1000 II |
6 giờ |
|||
|
Cồn 1000 III |
8 giờ |
|||
|
|
Xylen I |
4 giờ |
|
|
|
|
Xylen II |
8 giờ |
|
|
|
|
Xylen III |
10 giờ |
|
|
|
|
Paraffin I |
4 giờ |
|
|
|
|
Paraffin II |
6 giờ |
|
|
|
|
Paraffin III |
10 giờ |
|
|
Quy trình chuyển máy
Áp dụng cho các mảnh sinh thiết và các mảnh mô nhỏ:
Thời gian cố định tối thiểu 3 giờ.
Rửa nhẹ trong nước chảy.
Cồn 800 10 phút
Cồn 950 3 lần x 15 phút /lần
Cồn 1000 3 lần x 15 phút /lần
Cồn 1000/xylen t lệ 1/1 15 phút
Xylen 2 lần x 15 phút /lần
Paraffin 3 lần x 15 phút /lần (*)
Paraffin trong hút chân không từ 15 – 20‘.
Nếu không có hút chân không ở thì (*) tăng thêm mỗi lần 5‘ – Đúc bloc.
Áp dụng cho các mô thông thường:
|
Cồn 800 |
1 giờ |
|
Cồn 950 |
3 lần x 1 giờ /lần |
|
Cồn 1000 |
3 lần x 1 giờ /lần |
|
Xylen |
3 lần x 1 giờ /lần |
|
Paraffin |
3 lần x 1 giờ /lần |
|
Paraffin trong hút chân không |
1 giờ |
Đúc bloc.
Vùi và đúc bloc:
Mục đích: Tạo khuôn cho bệnh phẩm để khi cắt không làm biến dạng tế bào và cấu trúc của chúng. Chất được dùng làm khuôn phổ biến nhất là paraffin có nhiệt độ nóng chảy phù hợp từ 56 – 580C.
Có 2 yêu cầu cơ bản:
Bệnh phẩm định hướng mô học đúng.
Thao tác nhanh để bệnh phẩm, paraffin và cassette gắn kết vững chắc.
Kỹ thuật cắt và dán mảnh
dao cắt. yêu cầu:
Sắc
Không sước hoặc mẻ
một số điều kiện để cắt tốt:
Nhiệt độ phòng cắt 250C
Độ nghiêng lưỡi dao 450
dán mảnh cắt: thường dùng albumin với độ pha loãng 2% và hơ nóng dưới 500c.
Nhuộm
Trong kỹ thuật mô học, người ta có thể sử dụng cùng lúc nhiều loại phẩm nhuộm khác nhau để nhuộm nhiều chất hay nhiều thành phần khác nhau có trong một mô với nguyên tắc cơ bản là: Các phẩm nhuộm phải bắt màu chọn lọc trên từng chất hoặc trên từng thành phần mà không cản trở sự bắt màu của phẩm nhuộm thứ hai.
Một nguyên tắc nữa trong kỹ thuật mô học cũng cần đề cập một nguyên tắc nữa là nhuộm tương phản:
Xanh – Đỏ
Đỏ – Đen, v.v…
Phương pháp nhuộm hematoxylin-eosin chuẩn cho mảnh cắt paraffin
Nguyên tắc:
Là phương pháp nhuộm phối hợp thông dụng nhất bằng cách nhuộm kế tiếp một phẩm nhuộm bazơ- hematein và một phẩm nhuộm bào tương axit – eosin.
Việc nhuộm nhân được nhuộm ―tăng dần‖ người ta dừng lại khi những cấu trúc của nhân rõ nét nhất. Ngược lại với việc nhuộm bào tương ―giảm dần‖ bằng cách nhuộm sẫm lên rồi loại phẩm thừa bằng cồn có độ thấp.
Tiến hành
Tiêu bản tẩy paraffin trong 3 lần xylen, mỗi lần 2 phút
Loại xylen bằng cồn 1000, cồn 950 mỗi lần 2 phút
Rửa nước chảy 5 phút
Loại các sắc tố do thuốc cố định nếu bệnh phẩm được cố định trong các dung dịch cố định có thu ngân (HgClơ2) hoặc Crom (Cr2O3) v.v… Sau đó rửa nước chảy 5 phút.
Nhuộm nhân trong một dung dịch Alum hematoxylin tuỳ ý với thời gian thay đổi tuỳ từng loại thuốc nhuộm.
Rửa kỹ trong nước chảy cho tới khi mảnh cắt có màu xanh thường từ 5 phút hoặc lâu hơn.
Biệt hoá trong cồn acid 1 (1ml HCl nguyên chất trong 100 ml cồn 700)
Rửa kỹ trong nước chảy cho tới khi mảnh cắt có màu xanh trở lại (10 – 15 phút) hoặc nhúng trong một dung dịch kiềm (nước ammoniac loãng) khoảng 5 phút rồi rửa nước.
Nhuộm trong dung dịch Eosin Y 1 10 phút.
Rửa nước chảy 1 – 5 phút.
Tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, làm trong và gắn lamelle.
Kết quả
Nhân tế bào xanh/đen
|
Cole‘s |
20- 45 phút |
|
Delafield‘s |
15 – 20 phút |
|
Ehrlich‘s Mayer‘s (tăng dần) |
20 – 45 phút |
|
Mayer‘s (tăng dần) |
10 – 20 phút |
|
Mayer‘s (giảm dần) |
5 – 10 phút |
|
Harris‘s (tăng dần khi nhuộm tế bào) |
4 – 30 phút |
|
Harris‘s (giảm dần) |
5 – 15 phút |
Bào tương thay đổi từ hồng đến hồng sẫm
Các sợi cơ hồng sẫm đến đỏ
Hồng cầu vàng da cam hoặc đỏ
Các sợi fibrin hồng thẫm
Giới thiệu một số dung dịch hematoxylin và thời gian nhuộm.
Gill‘s (giảm dần) 5 – 15 phút
Tiêu chuẩn của một tiêu bản cắt nhuộm he đạt yêu cầu
Mảnh cắt mỏng đều, không gấp, xước hoặc rách
Kích thước của mảnh cắt to gần bằng thật
Hơ không giãn quá
Nhân tế bào có màu xanh đến xanh đen
Bào tương có màu từ hồng đến đỏ
Hồng cầu màu da cam hoặc đỏ đậm
Các sợi cơ hồng đến đỏ
Không bị ám nước
Không có bọt khí
