Nguyên tắc
Đỏ Congo là phẩm nhuộm acid nhóm diazo, gồm hai nửa giống nhau, trong đó, mỗi nửa có vòng phenol gắn với nhóm phân tử naphtalen nhờ nhóm diazo. Hai nhóm phenyl gắn với nhau bằng liên kết diphenyl. Tuy nhiên, việc nhuộm chất dạng tinh bột (amyloid) bằng đỏ Congo là nhờ liên kết hydrogen khác với liên kết hóa điện tử được tạo ra giữa phẩm nhuộm và hầu hết các thành phần mô được nhuộm. Trong dung dịch nước, đỏ Congo nhuộm nhiều thành phần mô khác nhau, mặc dù ái lực với chất dạng tinh bột lớn hơn đối với thành phần khác.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): đỏ Congo, chlorit sodium, hydroxit sodium, alun hematoxylin.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Dung dịch A lưu trữ: Chlorit sodium bão hòa trong 80% etanol.
Dung dịch B lưu trữ: đỏ Congo bão hòa trong 80% etanol được bão hòa bằng chlorit sodium.
1% dung dịch nước hydroxit sodium.
Dung dịch làm việc
Cứ 100 ml dung dịch A lưu trữ thêm 1 ml dung dịch nước hydroxit sodium 1% rồi lọc.
Cứ 100ml dung dịch B lưu trữ thêm 1ml dung dịch nước hydroxit sodium 1% rồi lọc.
Tiến hành kỹ thuật
Tẩy parafin mảnh cắt bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút
Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
Rửa trong nước cất 3 – 5phút
Nhuộm nhân trong alun hematoxylin, biệt hóa và làm xanh
Nhúng trong dung dịch chlorit sodium kiềm x 20 phút
Chuyển ngay sang dung dịch đỏ Congo kiềm x 20 phút
Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
Gắn lá kính.
Kết quả
Chất dạng tinh bột, sợi chun, hạt bạch cầu ưa toan: đỏ
Nhân: xanh
Những sai sót và hướng xử trí
Mặc dù dung dịch lưu trữ có khả năng ổn định khoảng 2 tháng, nhưng để có màu sắc tốt, không nên để lưu dung dịch làm việc mà chỉ sử dụng trong khoảng 20 phút sau chuẩn bị.
Để bão hòa trong 100ml etanol 80%, cần sử dụng 0,2g phẩm đỏ Congo. Lưu giữ dung dịch trong tủ lạnh.
