NHUỘM GIEMSA TRÊN PHIẾN ĐỒ
Nguyên tắc
Phương pháp nhuộm Giemsa được gọi theo tên của nhà vi khuẩn học người Đức, Gustab Giemsa (1867-1948), khi ông sử dụng phương pháp này để tìm ký sinh trùng sốt rét và các ký sinh trùng khác (các sinh vật đơn bào, xoắn khuẩn) trên phiến đồ tế bào học. Sau đó, kỹ thuật còn được áp dụng cho nhuộm các Chlamydia, phiến đồ máu, các thể vùi virus. Nguyên lý của phương pháp này dựa trên nhóm phophat của phẩm nhuộm gắn với liên kết adenin – thymin, liên kết có nhiều ở DNA trong tế bào. Phản ứng oxy hóa sẽ tạo ra màu xanh của metylen ở nhân tế bào, bào tương tế bào có thể bắt màu xanh hoặc hồng. Hiện nay, phương pháp nhuộm Giemsa được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán tế bào học trên các phiến đồ chọc hút kim nhỏ hay phiến đồ áp.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Phương tiện, hóa chất
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn 95o.
Cồn etanol 1000.
Xylen.
Nước cất
Phẩm nhuộm Giemsa.
Lá kính.
Chất gắn Permount.
Giá đựng phiến đồ (đứng và nằm ngang).
Kính hiển vi quang học.
Phiếu xét nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Găng tay các loại, khẩu trang, áo choàng y tế.
Các bước tiến hành
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Pha phẩm nhuộm: có thể dùng dung dịch pha sẵn bán trên thị trường. Nếu không có phẩm nhuộm bán sẵn, pha phẩm nhuộm như sau (cách pha của L.G.Koss,1992):
Azur II cosin: 2g
Azur II: 1g
Azur B – cosin: 1g
Azur A – cosin: 0,5g
Trộn 250ml glycerin với 250ml cồn metanol
Hoà tan các thuốc nhuộm trên vào dung dịch glycerin cồn metanol đã trộn.
Để yên thuốc qua đêm ở nhiệt độ phòng (tốt nhất, nên để ở tủ ấm).
Lắc mạnh hỗn hợp từ 5 – 10 phút
Đổ không cần lọc vào 1 lọ thuỷ tinh tối màu, nút mài, bảo quản ở nhiệt độ phòng (ta được dung dịch Giemsa mẹ).
Tiến hành nhuộm
Phiến đồ sau khi đã được cố định, tiến hành các bước sau:
Pha loãng 5ml dung dịch Giemsa mẹ vào 65ml nước.
Nhúng phiến đồ vào nước cất: 15 lần
Nhuộm trong Giemsa pha loãng: 2 giờ
Nhúng nhanh phiến đồ qua acid acetic 1%: 1 lần
Thấm khô phiến đồ bằng giấy thấm
Nhúng trong cồn etanol 1000: đến lúc cồn ra khỏi phiến kính chỉ có màu xanh lơ nhạt mới thôi.
Nhúng qua xylen I: 10 lần nhúng Nhúng qua xylen II: 10 lần nhúng Gắn lá kính bằng Permount.
Kết quả
Sắt/ hemosiderin: màu xanh.
Hồng cầu: màu vàng.
Bạch cầu đa nhân trung tính: màu tím
Bạch cầu đa nhân ái toan: màu đỏ
Các loại tế bào khác: nhân màu tím đỏ, bào tương xanh nhạt.
Những sai sót và hướng xử trí
Độ dày của các phiến đồ cần được chuẩn bị đúng cách (tùy loại xét nghiệm), cần để khô trước khi nhuộm.
Thời gian nhuộm phụ thuộc loại bệnh phẩm và độ dầy của bệnh phẩm, nhiệt độ phòng.
Khi nhuộm, cần phủ đủ lượng phẩm nhuộm trên phiến đồ, phủ kín phần có bệnh phẩm, tránh để phiến đồ bị khô trong thời gian nhuộm và bệnh phẩm trên phiến đồ bị bỏ sót không được nhuộm, sẽ không đánh giá đúng tổn thương.
Khâu rửa nước không tốt sẽ để lại cặn thuốc nhuộm trên phiến đồ. Khắc phục bằng cách lọc phẩm nhuộm trước khi dùng, rửa phiến đồ dưới vòi nước chảy.
Nước chảy phải sạch, không có cặn, vì cặn bẩn sẽ bám lại trên phiến đồ. Có thể sử dụng nước qua lõi lọc hoặc dùng bông để lọc nước.
Không sử dụng phẩm nhuộm khi đã hết hạn sử dụng, do vậy, cần kiểm tra hạn dùng của phẩm nhuộm trước khi tiến hành nhuộm.
Để đảm bảo chất lượng phẩm nhuộm Giemsa mẹ, cần đậy chặt nút chai phẩm nhuộm để tránh bay hơi. Thuốc nhuộm đã pha loãng, phải dùng ngay, dùng không hết phải bỏ đi. Không dùng lại thuốc nhuộm thừa, để lại từ trước.
