Nguyên tắc
Kỹ thuật này dùng để phát hiện nấm, pneumocystis carinii dựa theo nguyên lý kỹ thuật Gomori trong bạc – methenamine. Nguyên lý chung của phản ứng gần giống với nguyên lý trong phản ứng PAS: nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng acid chromic hoặc permanganate sẽ tạo ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd này nhờ vào hiện tượng thủy phân phức chất bạc – methenamine.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 02
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất chung
Dung dịch cố định bệnh phẩm.
Cồn (700, 800, 950 , 1000).
Xylen hay toluen.
Nước cất 2 lần.
Parafin.
Sáp ong.
Albumin + glycerin.
Máy đo độ pH điện tử.
Máy chuyển bệnh phẩm tự động.
Máy đúc khối parafin.
Bàn hơ dùng điện.
Máy cắt lát mỏng (microtome).
Lưỡi dao cắt lát mỏng.
Lò nấu parafin.
Tủ ấm 370 và 560.
Tủ lạnh.
Điều hòa nhiệt độ.
Tủ hốt phòng thí nghiệm.
Nguồn cấp nước chảy.
Bể nhuộm bằng thủy tinh.
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.
Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.
Khuôn nhựa.
Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).
Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Cân phân tích.
Giấy lọc.
Phiến kính, lá kính.
Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.
Dung dịch nhựa tổng hợp gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.
Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): dung dịch bạc – methenamin, dung dịch xang lá cây sáng (Vert lumière) SF, dung dịch nước hàn the (borax), acid acetic đậm đặc, dung dịch chlorua vàng.
Các bước tiến hành
Cố định
Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.
Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:
Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Dung dịch bạc – methenamin
Dung dịch mẹ
Hexamethylen tetramin 3%: 100ml
Bạc nitrat 5%: 5ml
Chú ý: cho từ từ bạc nitrate vào hexamethylen tetramin sẽ được một tủa trắng. Ngay sau đó, tủa này tự hòa tan. Có thể bảo quản dịch ở tủ lạnh trong nhiều ngày.
Dung dịch pha trước khi dùng:
|
Dung dịch nước hàn the: Nước cất: Dung dịch mẹ: Dung dịch xanh lá cây sáng Dung dịch mẹ |
2ml 25ml 25ml |
|
Xanh lá cây sáng: Nước cất: Acid acetic đậm đặc: |
0,2g 100ml 0,2ml |
Dung dịch pha trước khi dùng
|
Dung dịch mẹ: Nước cất: |
|
10ml 50ml |
Tiến hành kỹ thuật
Các mảnh cắt được tẩy parafin qua 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút
Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút
Rửa trong nước cất 3 – 5 phút
Oxy hóa trong dung dịch acid chromic 5% trong 1giờ
Rửa nước chảy 2 – 3 phút
Rửa trong dung dịch bisunfit Na 1% trong 1phút
Rửa qua nước chảy: 5 – 10 phút
Rửa trong 3 – 4 bể nước cất: mỗi bể 5 lần nhúng
Ngâm trong dung dịch bạc – methenamin ở nhiệt độ 58º khoảng 30 – 60 phút cho đến khi mảnh cắt có màu vàng nâu
Lấy mảnh cắt ra, ngâm trong nước cất. Kiểm tra màu sắc dưới kính hiển vi. Rửa trong 6 bể nước liên tiếp, mỗi bể 5 lần nhúng.
Thúc trong dung dịch chlorua vàng trong 2 – 5 phút
Rửa trong nước cất
Loại bỏ bạc thừa bằng dung dịch hyposunfit Na 2% trong 2 – 5 phút
Rửa nước thật kỹ
Nhuộm nền bằng xanh lá cây sáng: 30 – 50 giây
Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°
Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
Gắn lá kính bằng dung dịch nhựa tổng hợp.
Kết quả
Nấm: màu nâu đen – đen
Chất nền: xanh nhạt
Chất nhầy: màu ghi đậm.
Những sai sót và hướng xử trí
Dung dịch bạc – methenamin là chất oxy hóa có độc tính cao, do đó khi tiếp xúc với dung dịch phải rất cẩn thận, phải đeo khẩu trang, găng tay và phải ở nơi thoáng gió. Có thể giữ dung dịch ở 4°C trong vài tháng.
Khi nhuộm, cần có mảnh cắt chứng đã có thành phần nấm dương tính với phẩm nhuộm này. Nếu mảnh cắt âm tính giả, nên kiểm tra hạn dùng của dung dịch bạc – methenamin để thay dung dịch mới hoặc để thời gian nhuộm lâu hơn.
Trong bước 9 của quy trình nhuộm, dung dịch methenamin được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng và cần hâm nóng đến 58°C bằng cách nhanh nhất, mảnh cắt sẽ được tráng màu nâu vàng bằng dung dịch bạc – methenamin và được kiểm tra mức độ bắt màu.
