Nguyên tắc
Nhuộm Papanicolaou còn được gọi là “nhuộm PAP”, là một loại kỹ thuật tế bào học nhuộm đa sắc, dùng để phân biệt tế bào trên phiến đồ được lấy từ các dịch hoặc từ tế bào bong của cơ thể. Cho đến nay, cơ chế nhuộm của kỹ thuật vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ. Dạng kinh điển của nhuộm PAP gồm 5 loại phẩm màu, được pha thành 3 dung dịch:
Hematoxylin (phẩm nhuộm base): nhuộm nhân tế bào
Orang G (gồm acid photphotungstic và OG-5, OG-8): nhuộm chất keratin có trong tế bào.
Phẩm EA (Eosin Azure): gồm 3 loại phẩm (EA-36, EA-50, EA-65). Eosin Y nhuộm các tế bào vảy bề mặt, hạt nhân, hồng cầu. Xanh lá cây nhạt SF (Light Green). Ánh vàng dùng để nhuộm bào tương của các loại tế bào khác (tế bào vảy không sừng hóa). Nâu Bismarck Y do không nhuộm thành phần nào nên trong công thức nhuộm hiện tại, một số phòng xét nghiệm đã bỏ đi.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh – tế bào bệnh học: 01
Phương tiện, hóa chất
Dung dịch cố định phiến đồ: cồn/ete tỷ lệ 1/1.
Cồn (50o,70o, 80o, 90o, 95o, 100o)
Cồn – acid 0,5% (5ml acid HCl với 1000ml cồn 50o).
Xylen (toluen) Nước cất 2 lần
Lá kính, phiến kính.
Tủ ấm 37o và 56o
Tủ lạnh
Điều hòa nhiệt độ
Tủ hốt phòng thí nghiệm
Bể nhuộm bằng thủy tinh
Bể thủy tinh đựng cồn, xylen
Giá đựng phiến đồ (đứng và nằm ngang) Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.
Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.
Kẹp không mấu, kéo.
Giấy lọc
Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.
Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.
Nguồn cấp nước chảy.
Kính phòng hộ, găng tay, khẩu trang, áo choàng.
Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây), bao gồm: Hematoxylin Harris, dung dịch màu da cam (Orange G), hỗn hợp EA50, dung dịch xylen – cồn, dung dịch cồn – ete.
Các bước tiến hành
Cố định
Chuẩn bị phẩm nhuộm
Hematoxylin Harris (xem phần nhuộm HE)
Dung dịch màu da cam (Orange G) (có sẵn trên thị trường)
Orange G 0,5% trong cồn 95º 100ml
Acid Photphotungstic 0,015g
Hỗn hợp EA50 (có sẵn trên thị trường)
|
Xanh nhạt – vàng nhạt ( Light Green SF – yellowish) Nâu BISMARCK Y (Bismarck brown Y) Eosin vàng nhạt Nước cất vừa đủ Cồn 96º Cồn (metanol) tuyệt đối Acid Photphotungstic trong cồn 50º (1,7g/5ml) Lithicacbonat bão hòa Acid acetic lạnh |
0,375g 0,4g 2,5g 50ml 609g 160g 5ml 0,5ml 1ml |
Dung dịch xylen – cồn
Cồn etanol tuyệt đối – xylen 40%: tỷ lệ 1/1
Dung dịch cồn – ete
Cồn 95º – ete: tỷ lệ 1/1
Tiến hành kỹ thuật
Phiến đồ được cố định trong cồn – ete: 30 giây
Chuyển liên tục trong các bể cồn 80º, 70º rồi 50º, mỗi bể 5 lần nhúng
Rửa nước cất
Nhuộm trong hematoxylin Harris: 3 – 6 phút
Rửa nước cất
Nhúng 5 – 6 lần trong dung dịch HCl 0,25%
Rửa nước chảy trong 6 phút rồi qua nước cất khoảng 30 giây
Chuyển liên tục trong các bể cồn 50º, 70º, 80º rồi 95º: mỗi bể 5 lần nhúng
Nhỏ Orange G phủ kín bệnh phẩm: khoảng 1 – 3 phút
Chuyển liên tục qua 2 bể cồn 95º: mỗi bể 5 lần nhúng
Nhuộm trong hỗn hợp đa sắc “EA50” trong khoảng 1 – 4 phút
Chuyển liên tục trong các bể cồn 95º rồi 100º: mỗi bể 5 lần nhúng
Khử nước bằng cồn 95° và 100°
Làm trong bằng 3 bể toluen sạch
Gắn lá kính bằng bôm như thường lệ.
Kết quả
Nhân: xanh xám hoặc tím
Bào tương tế bào ưa acid: đỏ hồng, đỏ tươi hoặc vàng da cam
Các tế bào ưa base: xanh nhạt, đôi khi xanh ve nhạt.
Những sai sót và hướng xử trí
Cần tuân thủ thời gian nhuộm nhân bằng hematoxylin vì nếu không nhân tế bào sẽ rất đậm màu, dễ gây hiện tượng dương tính giả.
