Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện JC/BK virus trong bệnh phẩm máu và dịch não tủy, nước tiểu.
Nguyên lý
Xác định định tính và định lượng gen đặc trưng virus JC/BK bằng kỹ thuật real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0,001 |
|
3 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
1,000 |
|
9 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
2,000 |
|
10 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
11 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
1,100 |
|
12 |
Kit tách DNA |
Test |
2,100 |
|
13 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
|
14 |
ống Falcol 50 ml |
Cái |
0,010 |
|
15 |
Eppendorf 1,7 ml |
Tube |
2,100 |
|
16 |
Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
2,100 |
|
17 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
6,000 |
|
18 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
12,000 |
|
19 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
6,000 |
|
20 |
Ethanol BDH |
ml |
2,000 |
|
21 |
Water-DEPC Treated |
ml |
1,000 |
|
22 |
Giá đỡ PCR tube |
Cái |
0,001 |
|
23 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
24 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
25 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
26 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
27 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
28 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
29 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
30 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
31 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
32 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
33 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
34 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
35 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Máu, nước tiểu, huyết tương, dịch não tủy.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm Geno-Sen JC/BK Virus (Rotor Gene) Real-time PCR (VD).
Tách chiết dna
Thực hiện phản ứng real-time pcr
Thực hiện bước này trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Lấy đủ số tube 0,2 ml cần dùng.
Chuẩn bị MasterMix (bao gồm JC/BK Mix, Mg. Sol JC/BK, IC) và phân phối vào các tube 0,2 ml.
Cho Standards, chứng – hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” và “JOE” cho mẫu, Standards và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Các chứng chuẩn có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính.
Phân tích mẫu định tính
Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận “Mẫu dương tính”.
Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm.
Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy virus trong mẫu”. Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
Phân tích mẫu định lượng
Mẫu chuẩn (JC/BK Standard – S 1-5) để định lượng được cung cấp trong bộ kit đã biết trước nồng độ, được tính theo copies/ml và được xử lý cùng một phương pháp với mẫu bệnh phẩm.
|
Standard 1: 105 copies/ml |
= |
25.000.000 copies/ml |
|
Standard 2: 104 copies/ml |
= |
2.500.000 copies/ml |
|
Standard 3: 103 copies/ml |
= |
250.000 copies/ml |
|
Standard 4: 102 copies/ml |
= |
25.000 copies/ml |
|
Standard 5: 101 copies/ml |
= |
2.500 copies/ml |
Áp dụng công thức sau để qui đổi giá trị đã được xác định của mẫu bệnh phẩm sang copies/ml bằng cách sử dụng đường cong chuẩn:
Kết quả (copies/ml) = Kết quả đo được (copies/ml) x Thể tích mẫu tách chiết (µl)
Thể tích bệnh phẩm (ml)
In đồ thị kết quả
Những sai sót và xử trí
Ống giữ mẫu máu được gắn chất chống đông có thể ức thế phản ứng PCR.
Khi sử dụng phương pháp tách chiết trong đó có bước dùng buffer để loại bỏ ethanol, phải thực hiện thêm bước ly tâm trước khi tiến hành bước thôi rửa để loại bỏ ethanol còn sót lại. Điều này giúp ngăn ngừa sự ức chế phản ứng PCR.
Để dựng thành đường chuẩn, phải sử dụng tất cả mẫu chuẩn (JC/BK S 1-5).
Trước khi sử dụng, tất cả thuốc thử cần phải được rã đông hoàn toàn và hòa trộn với nhau (pipet và vortex ngắn).
