ĐỊNH LƯỢNG FATTY ACID BIDING PROTEIN (H-FABP)
H-F BP (Fatty Acid Binding Protein) là protein vận chuyển cid béo và được xem là một dấu ấn sinh học tim mạch.
Protein gắn với acid béo (H-FABP) là protein bào tương khoảng 15kDa gắn với acid béo chuỗi dài có vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid. Có các loại FABP khác nhau: tim (H-FABP) gan (Liver-F BP), và ruột. Cơ tim người có nồng độ cao H-FABP là một maker nhạy với xơ hóa cơ tim và dùng trong chẩn đoán và theo dõi nhồi máu cơ tim.
NGUYÊN LÝ
Kỹ thuật định lượng H-FABP dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch gắn Enzym (ELISA). Kỹ thuật sử dụng kháng thể nguồn gốc thỏ tinh chế ái lực kháng với H-FABP cố định vào pha rắn (giếng) và một kháng thể thứ 2 kháng với H-FABP có gắn với enzym peroxidase. H-FABP trong mẫu phản ứng trực tiếp với các kháng thể 1 và 2 kết quả hình thành kiểu phức hợp sandwich với 3 thành phần mà phân tử HFABP ở giữa. Sau khi ủ dung dịch sẽ có màu xanh do peroxidase xúc tác phân giải TMB. Phản ứng đựơc dừng lại khi thêm dung dịch dừng phản ứng và hỗn hợp sẽ chuyển màu xanh sang vàng và được đo ở 450 nm. Nồng độ H-FABP tỷ lệ thuận với đậm độ màu đo được.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện: 01 cán bộ đại học, 01 kỹ thuật viên được đào tạo chuyên ngành Hóa sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện
Pipet thể tích 50, 100, 150, và 300 ul
Đầu pipet dùng 1 lần.
Các ống xét nghiệm được chống đông bằng Li-Heparin hoặc EDTA hoặc không chống đông.
Máy lắc
Máy đọc màu giếng ELISA với kính lọc 450 nm, OD >2. 0
Hoá chất
+ Giếng (đĩa) chứa kháng thể thỏ kháng H-FABP. (đĩa chứa 96 giếng trong túi nắp kéo, có chất hút ẩm). Lưu trữ 2 – 8oC
+ Dung dịch kháng thể gắn enzym
+ Dung dịch chất nồng độ chuẩn (250 ul), 1000 ng/ml H-FABP thỏ (bảo quản ở -20°C).
+ Dung dịch pha loãng
+ Đệm rửa
+ Thuốc thử TMB (One-Step).
+ Dung dịch dừng phản ứng (1N HCl).
Bệnh phẩm
+ Huyết thanh.
+ Huyết tương (chống đông bằng Li-Heparin, EDTA)
Người bệnh: Đã được tư vấn xét xét nghiệm, chuẩn bị tư tưởng khi khám bệnh, nhịn ăn sáng để lấy máu.
Phiếu xét nghiệm: Được chỉ định xét nghiệm định lượng định lượng H-FABP
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Mẫu huyết thanh hoặc huyết tương không cần xử lý trước. Trường hợp cần thiết thì pha loãng mẫu.
Tất cả các thuốc thử phải đạt nhiệt độ phòng trước khi xử dụng. Mẫu bệnh, mẫu chứng, mẫu chuẩn phải được xét nghiệm 2 lần.
Chuẩn bị mẫu chuẩn
Làm tan đông chuẩn H-FABP nồng độ 1000 ng/ml.
Đánh dấu 7 ồng nghiệm với các nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,56; và 0 ng/ml.
Lấy 540 µl của dung dịch hòa loãng vào ống đánh dấu 100ng/ml và 300 µl vào các ống còn lại
Lấy 60µ l dung dịch chuẩn 1000 ng/ml H-FABP vào ống đánh dấu 100 ng/ml và lắc. Đây là dung dịch chuẩn nồng độ H-FABP 100 ng/ml.
Chuẩn bị mẫu chuẩn H-FABP nồng độ 50 ng/ml bằng cách trộn 300 µl dung dịch hòa loãng với 300 µl dung dịch chuẩn H-FABP 100 ng/ml. tương tự làm với các mẫu chuẩn H-FABP 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,56 ng/ml. Để dung dịch chuẩn H-FABP 1000 ng/ml bảo quản ở -200C.
Các bước phân tích
Đặt các bản giếng vào bộ phận cố định
Hút 100 µl các dung dịch chuẩn và mẫu thử vào các giếng
Cho vào mỗi giếng 100 µl dung dịch kháng thể gắn enzym (Enzyme Conjugate)
Ủ ở nhiệt độ phòng (180C – 250C) trong 60 phút với máy lắc nhẹ 100 rpm
Loại bỏ dung dịch trong các giếng bằng cách lắc nhẹ bản giếng vào chỗ bồn chứa chất thải sinh học hoặc bằng máy rửa
Rửa các giếng 5 lần bằng đệm rửa mỗi lần 400 µl
Úp ngược bản giếng vào giấy thấm để loại hết nước rửa
Cho 100 µl dung dịch TMB vào các giếng. lắc 10 giây
Ủ trong tối, nhiệt độ phòng 20 phút
Dừng phản ứng bằng cách thêm 100 µl dung dịch dừng vào mỗi giếng
Lắc 30 giây. Đảm bảo tất cả dung dịch màu xanh đã chuyển thành màu vàng ngay.
Đo mật độ quang ở bước sóng 450 nm với máy đọc bản giếng trong vòng 15 phút. Khi mật độ quang quá giới hạn đo có thể đo thay thế ở bước sóng 405 nm.
Tính kết quả.
Tính kết quả trung bình cho mỗi mẫu chuẩn và mẫu thử
Vẽ đường chuẩn dựa vào mật độ quang đo được và nồng độ chuẩn
Dựa vào đường chuẩn tính ra nồng độ H-FABP mẫu thử dựa trên mật độ quang đo được.
Mật độ quang tham khảo
|
H-FABP (ng/ml) |
Absorbance (450nm) |
|
100 |
1,273 |
|
50 |
0,856 |
|
25 |
0,579 |
|
12,5 |
0,378 |
|
6,25 |
0,278 |
|
3,125 |
0,216 |
|
1,56 |
0,196 |
|
0 |
0,165 |
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Khi nhồi máu cơ tim H-FABP vào máu rất nhanh do kích thước nhỏ và độ hòa tan tốt. H-FABP tăng sớm sau nhồi máu cơ tim 3 giờ và trở về bình thường trong vòng 12 đến 24 giờ.
NHỮNG SAI SÓT VÀ SỬ TRÍ
Như các kỹ thuật ELISA đòi hỏi người làm có kinh nghiệm và độ lặp lại cao
Quá trình rửa có ý nghĩa quan trọng nếu rửa không đầy đủ và không kỹ dẫn đến kết quả sai và mật độ quang tăng giả tạo.
