Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định sự có mặt gen đặc trưng của Adenovirus từ bệnh phẩm (dịch viêm kết mạc mắt, dịch đường hô hấp…).
Nguyên lý
Xác định gen đặc trưng của Adenovirus dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).
Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Tăm bông vô trùng |
Cái |
1,000 |
|
2 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,100 |
|
3 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
4 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
5 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
6 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
1,200 |
|
7 |
Kit tách DNA |
Test |
2,200 |
|
8 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
|
9 |
ống Falcol 50 ml |
Cái |
0,010 |
|
10 |
Eppendorf 1,7 ml |
Tube |
2,200 |
|
11 |
Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
2,200 |
|
12 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
13 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
14 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
5,200 |
|
15 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
16 |
Water-DEPC Treated |
ml |
1,000 |
|
17 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
18 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
19 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
20 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
21 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
22 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
23 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
24 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
25 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
26 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
27 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
28 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
29 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
30 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch viêm kết mạc mắt, dịch đường hô hấp…
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật:
Bộ sinh phẩm Real-time PCR định tính Adenovirrus
Tách chiết dna
Có thể dùng kit tách chiết DNA bằng hoá chất phenol/chloroform hoặc tách chiết bằng cột của các nhà sản xuất khác như Qiagen, Stratec, Roche…
Thực hiện phản ứng real-time pcr
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
Cho chứng +, chứng – hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube Adenovirrus rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” và “CY5” và cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính.
Phân tích mẫu
Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dương hoặc âm.
Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả
Những sai sót và xử trí
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân:
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
