Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định trình tự nucleotide đặc trưng cho từng genotype của Enterovirus 71 (EV 71) trong các loại dịch tiết đường hô hấp, các loại dịch khác và phân.
Nguyên lý
Xác định trình tự nucleotide đặc trưng cho từng genotype của EV71 bằng kỹ thuật giải trình tự gen.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy PCR.
Máy điện di.
Máy đọc điện di.
Máy giải trình tự gen.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Bộ lưu điện.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (-20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
kg |
0,001 |
|
2 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
3 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
7 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
8 |
Găng không có bột |
Cái |
0,500 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng |
Test |
1,350 |
|
11 |
Kit tách chiết RNA từ virus |
Test |
2,350 |
|
12 |
DNA marker |
Bộ |
1,000 |
|
13 |
Primer 1 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
14 |
Primer 2 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
15 |
Primer 3 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
16 |
Primer 4 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
17 |
Ống Eppendorf 1,5 ml |
Tube |
3,000 |
|
18 |
Ống Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
1,000 |
|
19 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,000 |
|
20 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
21 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
22 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
23 |
Ethanol BDH |
ml |
0,500 |
|
24 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
25 |
Thạch |
Gam |
0.075 |
|
26 |
Ladder |
ml |
0.0025 |
|
27 |
Blue Juice Gel loading dye |
ml |
0.003 |
|
28 |
Ethidium Bromide |
ml |
0.100 |
|
29 |
TAE Buffer |
ml |
0.100 |
|
30 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
31 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
32 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
33 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
34 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
35 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
36 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
37 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
38 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
39 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
40 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
41 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
42 |
Khăn lau tay |
cái |
0,010 |
|
43 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch hầu họng, dịch đường hô hấp, phân, và các loại dịch khác…
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết RNA tổng số.
Thực hiện phản ứng RT-PCR.
Thực hiện phản ứng PCR.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Giải trình tự gen.
Kiểm tra và so sánh trình tự gen của EV71 trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế.
Nhận định kết quả
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥ 90% mới có thể kết luận được genotype của EV71.
Những sai sót và xử trí
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết RNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
