Neisseria meningitidis nuôi cấy, định danh và kháng thuốc

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện và định danh N.meningitidis bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển.

Xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của N.meningitidis. 

Nguyên lý

Vi khuẩn được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học.

Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của N.meningitidis được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán và được phiên giải ra phân loại S, I, R dựa trên tài liệu hướng dẫn CLSI được cập nhật hàng năm.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Kính hiển vi quang học.

Dụng cụ sấy lam (nếu có).

Tủ ấm CO₂ Advatage – Lab.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Lọ lấy bệnh phẩm	lọ	1,000
2	Que lấy bệnh phẩm	cái	2,000
3	Lam kính	cái	4,000
4	Dầu soi kính	ml	2,000
5	Xylen lau kính	ml	2,000
6	Nước muối sinh lý	ml	15,000
7	Thuốc nhuộm đỏ fuchsin	ml	10,000
8	Thuốc nhuộm tím gentian	ml	10,000
9	Cồn tẩy 95 độ	ml	20,000
10	Lugol	ml	10,000
11	Môi trường nuôi cấy	test	1,500
12	Kháng sinh đồ sô cô la	đĩa	4,000
13	Khoanh giấy kháng sinh	khoanh	8,000
14	Dải giấy kháng sinh	cái	3,000
15	Tăm bông vô trùng	cái	1,000
16	Ống nghiệm thủy tinh	ống	1,000
17	Bông	kg	0,003
18	Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ)	ml	30,000
19	Đèn cồn	cái	0,0002
20	Panh	cái	0,0001
21	Khay đựng bệnh phẩm	cái	0,0001
22	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	cái	0,0001
23	Mũ	cái	0,060
24	Khẩu trang	cái	0,060
25	Găng tay	đôi	9,000
26	Găng tay xử lý dụng cụ	đôi	0,060
27	Quần áo bảo hộ	bộ	0,002
28	Acid ngâm lam	ml	20,000
29	Ống nghiệm thủy tinh	ống	1,000
30	Bút viết kính	cái	0,040
31	Bút bi	cái	0,020
32	Bật lửa	cái	0,020
33	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	tờ	0,001
34	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	6,000
35	Dung dịch nước rửa tay	ml	24,000
36	Khăn lau tay	cái	0,090
37	Giấy trả kết quả xét nghiệm	tờ	2,000
38	QC (nếu thực hiện) *		0,1
39	EQAS (nếu thực hiện) *		0,005

* Ghi chú: 

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch não tủy, dịch ngoáy họng mũi, tổn thương da.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1 và Phụ lục 6).

tiến hành kỹ thuật

Nhuộm soi

Nuôi cấy

Nuôi cấy trên môi trường sô cô la để ở điều kiện 37°C/5% CO₂.

Định danh

Thử nghiệm tính chất sinh vật hóa học.

Kháng sinh đồ

Thử nghiệm các khoanh giấy kháng sinh và thanh Etest trên môi trường Muller-Hinton máu theo hướng dẫn của CLSI.

Nhận định kết quả

Neisseria meningitidis có hình ảnh song cầu, hình hạt cà phê, bắt màu Gram âm (màu đỏ).

Nuôi cấy trên môi trường sô cô la (37°C/5% CO₂), khuẩn lạc dạng S, xám. 

Một số tính chất sinh vật hóa học: oxydase (+), glucose (+), maltose (+), lactose (-), saccarose (-).

Những sai sót và xử trí

Sai sót

Neisseria meningitidis có thể bắt màu không đúng do tẩy cồn chưa đủ hoặc làm đồ phiến quá dầy.  

Neisseria meningitidis có thể không mọc do đốt ăng quá nóng, điều kiện nuôi cấy không đảm bảo, lượng bệnh phẩm quá ít. 

Xử trí

Tuân thủ đúng các bước của quy trình nhuộm Gram.

Kiểm tra chất lượng thuốc nhuộm hàng tuần với chủng chuẩn.

Để ăng nguội trước khi tiến hành nuôi cấy; thường xuyên kiểm tra nhiệt độ, nồng độ CO₂ cho nuôi cấy.