Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định chính xác Vibrio cholera.
Nguyên lý
Bằng kỹ thuật giải trình tự nucleotide dựa trên trình tự gen 16S RNA ribosome của vi khuẩn.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn Sinh học cấp 2.
Máy PCR.
Máy đọc điện di.
Máy giải trình tự gen.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Micropipette.
Bộ lưu điện.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 3 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
kg |
0,001 |
|
2 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
3 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
7 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
8 |
Găng không có bột (DNase-RNase free) |
Cái |
0,500 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại |
Test |
1,350 |
|
11 |
Kit tách chiết DNA |
Test |
2,350 |
|
12 |
DNA marker |
Bộ |
1,000 |
|
13 |
Primer 1 |
ml |
0,0001 |
|
14 |
Primer 2 |
ml |
0,0001 |
|
15 |
Ống Eppendorf 1,5 ml |
Tube |
3,000 |
|
16 |
Ống Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
1,000 |
|
17 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,000 |
|
18 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
19 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
20 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
21 |
Ethanol BDH |
ml |
0,500 |
|
22 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
23 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
24 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
25 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
26 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
27 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
28 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
29 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
30 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
31 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
32 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
33 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
34 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
35 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
36 |
Khăn lau tay |
cái |
0,010 |
|
37 |
EQAS (nếu thực hiện)* |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Bệnh phẩm phân hoặc chủng Vibrio cholera nuôi cấy thuần.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm phân có thể lấy qua bô, lấy bằng tăm bông trực tràng. Đặc điểm phân thường trắng như nước vo gạo, không màu, không mùi, rất hiếm khi có nhày, máu.
Dụng cụ lấy phân phải có nắp xoáy, tốt nhất là 2 lớp, bên ngoài có thêm một lớp bảo vệ để tránh lây nhiễm. Bệnh phẩm sau khi lấy phải gửi ngay đến phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt, nếu quá 2 tiếng phải bảo quản trong môi trường Cary – Blair.
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết DNA tổng số.
Thực hiện PCR gen 16S ARN ribosome.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Giải trình tự gen.
Kiểm tra độ tương đồng DNA.
Nhận định kết quả
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gen đích phải có độ tương đồng ≥ 95% mới có thể kết luận được loài.
Những sai sót và xử trí
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại xét nghiệm.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
