Vibrio cholerae nuôi cấy, định danh và kháng thuốc
Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện và định danh V. cholerae bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển.
Xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của V. cholerae.
Nguyên lý
Vi khuẩn được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và tính chất kháng nguyên.
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của V. cholerae được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán và được phiên giải ra phân loại S, I, R dựa trên tài liệu hướng dẫn CLSI được cập nhật hàng năm.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Kính hiển vi quang học.
Dụng cụ sấy lam (nếu có).
Tủ ấm thường.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 01 mẫu bệnh phẩm/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Lọ lấy bệnh phẩm |
lọ |
1,000 |
|
2 |
Que lấy bệnh phẩm |
cái |
2,000 |
|
3 |
Lam kính |
cái |
4,000 |
|
4 |
Dầu soi kính |
ml |
2,000 |
|
5 |
Xylen lau kính |
ml |
2,000 |
|
6 |
Nước muối sinh lý |
ml |
15,000 |
|
7 |
Thuốc nhuộm đỏ Fuchsin |
ml |
10,000 |
|
8 |
Thuốc nhuộm tím Gentian |
ml |
10,000 |
|
9 |
Cồn tẩy 95 độ |
ml |
20,000 |
|
10 |
Lugol |
ml |
10,000 |
|
11 |
Môi trường nuôi cấy |
test |
1,500 |
|
12 |
Bộ sinh vật hóa học API 20 NE |
test |
1,000 |
|
13 |
Kháng sinh đồ Muller – Hinton |
đĩa |
1,000 |
|
14 |
Khoanh giấy kháng sinh |
khoanh |
5,000 |
|
15 |
Tăm bông vô trùng |
cái |
1,000 |
|
16 |
Ống nghiệm thủy tinh |
ống |
1,000 |
|
17 |
Bông |
kg |
0,003 |
|
18 |
Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ) |
ml |
30,000 |
|
19 |
Đèn cồn |
cái |
0,0002 |
|
20 |
Panh |
cái |
0,0001 |
|
21 |
Khay đựng bệnh phẩm |
cái |
0,0001 |
|
22 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
cái |
0,0001 |
|
23 |
Mũ |
cái |
0,060 |
|
24 |
Khẩu trang |
cái |
0,060 |
|
25 |
Găng tay |
đôi |
9,000 |
|
26 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
đôi |
0,060 |
|
27 |
Quần áo bảo hộ |
bộ |
0,002 |
|
28 |
Acid ngâm lam |
ml |
20,000 |
|
29 |
Ống nghiệm thủy tinh |
ống |
1,000 |
|
30 |
Bút viết kính |
cái |
0,040 |
|
31 |
Bút bi |
cái |
0,020 |
|
32 |
Bật lửa |
cái |
0,020 |
|
33 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
tờ |
0,001 |
|
34 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
6,000 |
|
37 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
24,000 |
|
38 |
Khăn lau tay |
cái |
0,090 |
|
39 |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
tờ |
2,000 |
|
40 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,1 |
|
41 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Phân của người bệnh.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1).
Tiến hành kỹ thuật
nhuộm gram và soi dưới kính hiển vi quang học.
nuôi cấy, định danh.
Nuôi cấy trên môi trường pepton kiềm, thạch kiềm và TCBS để ở điều kiện 37ºC. Sau mỗi 6 giờ cấy chuyển váng ở ống pepton kiềm sang môi trường thạch kiểm và TCBS. Khi nhìn thấy có khuẩn lạc nghi ngờ V. cholera mọc thì dừng không cấy chuyển nữa.
Bắt khuẩn lạc nghi ngờ.
Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng kít API 20E.
Ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu.
kháng sinh đồ.
Lựa chọn các khoanh giấy kháng sinh thử nghiệm cho V. cholerae theo hướng dẫn của CLSI để làm kháng sinh đồ bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán.
Nhận định kết quả
Định danh
Hình thái học: Vibrio cholerae có hình ảnh phẩy khuẩn, bắt màu Gram âm (màu đỏ).
Tính chất nuôi cấy: Nuôi cấy trên môi trường thạch kiềm (37ºC), khuẩn lạc dạng S, trong như giọt sương; trên môi trường TCBS, khuẩn lạc dạng S, màu vàng. Trong môi trường pepton kiềm, vi khuẩn mọc nhanh, sau 6 – 8h tạo thành váng trên mặt môi trường.
Một số tính chất sinh vật hóa học: lên men không sinh hơi đường glucose, saccharose, maltose, mannitol. Không lên men đường lactose, arabinose. Oxydase (+), indol (+), citrate simmons (+), LDC (+), ODC (+), ONPG (+). Urease (-), VP (±), ADH (-).
Phát hiện kháng thuốc
Đọc kháng sinh đồ và trả kết quả theo hướng dẫn của CLSI.
Những sai sót và xử trí
Sai sót
Vibrio cholerae có thể bắt màu Gram dương do tẩy cồn chưa đủ hoặc làm đồ phiến quá dầy.
Vibrio cholerae có thể không mọc do đốt ăng quá nóng, điều kiện nuôi cấy không đảm bảo, lượng bệnh phẩm quá ít.
Xử trí
Tuân thủ đúng các bước của quy trình nhuộm Gram.
Kiểm tra chất lượng thuốc nhuộm hàng tuần với chủng chuẩn.
Để ăng nguội trước khi tiến hành nuôi cấy.
