Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện sự có mặt bộ gene của Mycobacterium leprae có trong bệnh phẩm.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học tối thiểu cấp 2.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy vortex.
Máy chạy PCR.
Các loại pipet điều chỉnh được: 1000 µl, 200 µl, 100 µl, 10 µl.
Máy điện di.
Máy đọc ảnh gel.
Tủ lạnh thường.
Tủ âm sâu (-20°C).
Bộ lưu điện.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Dụng cụ lấy bệnh phẩm |
Que |
2,000 |
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
2 |
Găng không có bột (DNase-RNase free) |
Đôi |
0,500 |
|
3 |
Ống nhựa Ependoff 1.5ml |
ống |
2,000 |
|
4 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Hộp lưu bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Nước muối sinh lý |
ml |
5,000 |
|
7 |
Bộ KIT chiết tách DNA Đóng gói 50 phản ứng |
Hộp |
0,020 |
|
8 |
Khấu hao sinh phẩm cho chứng và QC kiểm tra lại, standard các loại |
Test |
1,350 |
|
9 |
PBS Buffer Đóng gói 500ml |
Chai |
0,002 |
|
10 |
Absolute Ethanol Đóng gói 1000ml |
Chai |
0,002 |
|
11 |
10mM dNTP mix Đóng gói 100µl |
ống |
0,005 |
|
12 |
Taq DNA Polymerase, Native Đóng gói: 5 units/ µl, 500 units(100 µl) |
ống |
0,002 |
|
13 |
Primer đặc hiệu cho vi khuẩn phong Đóng gói 50nM |
bp |
0,100 |
|
14 |
UltraPure DNase/RNase Distilled Water Đóng gói 500ml |
Chai |
0,001 |
|
15 |
Ultrapure Agarose Đóng gói 100g |
Lọ |
0,001 |
|
16 |
Ultrapure TBE Buffer 10X Đóng gói 1000ml |
Chai |
0,001 |
|
17 |
100bp DNA ladder Đóng gói 50ug |
ống |
0,001 |
|
18 |
10X BlueJuice Gel Loading dye Đóng gói 3x1ml |
ống |
0,001 |
|
19 |
Utrapure 10mg/ml Ethidium Bromide Đóng gói 10ml |
lọ |
0,001 |
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
20 |
Ống ly tâm 1,7ml Đóng gói 500c/túi |
túi |
0,004 |
|
21 |
ống PCR 0,2 ml, nắp phẳng Đóng gói: 500c/túi, 1000c/hộp |
hộp |
0,001 |
|
22 |
Đầu côn 1000ml có lọc |
túi |
0,001 |
|
23 |
Đầu côn 200ml có lọc |
túi |
0,004 |
|
24 |
Đầu côn 0,2-10µl có lọc |
túi |
0,001 |
|
25 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
1,000 |
|
26 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Quyển |
0,001 |
|
27 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
1,000 |
|
28 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
29 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
30 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
31 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
32 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
33 |
Bút viết kính, bút bi, diêm |
Cái |
0,020 |
|
34 |
Xà phòng |
Bánh |
0,010 |
|
35 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
|
36 |
Bông, cồn |
Túi |
0,010 |
|
37 |
EQAS (nếu thực hiện)* |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Các loại dịch tiết và mô sinh thiết.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).
tiến hành kỹ thuật
tách chiết dna từ bệnh phẩm.
pha hỗn hợp phản ứng pcr.
chạy phản ứng pcr.
điện di sản phẩm pcr.
đọc kết quả.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Phản ứng dương tính: có vạch sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi.
Phản ứng âm tính: không có vạch sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi.
Những sai sót và xử trí
Bệnh phẩm
Phòng xét nghiệm sẽ yêu cầu lấy lại bệnh phẩm khi phát hiện bệnh phẩm lấy, vận chuyển, bảo quản không đúng qui định. Nếu lâm sàng vẫn yêu cầu, phòng xét nghiệm sẽ thông báo mức độ kém chính xác của kết quả xét nghiệm.
Kỹ thuật
Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường.
Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế.
Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.
